HBV相關性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平檢測及意義

喻雪琴，張詩琬，陳芳，陳星，戢敏，梅怡晗，梅小平

（1.川北醫學院附屬醫院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫科大學，北京 100069）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是我國目前面臨的重大公共衛生問題之一，HBV感染后可形成急性乙型肝炎，部分急性肝炎會形成慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB），甚至可發展為肝衰竭、肝硬化及原發性肝癌。我國年均約有50萬人死于HBV感染所致肝病[1]。研究結果顯示，HBV是通過誘導機體發生一系列免疫反應來介導肝組織炎癥反應、肝纖維組織形成及肝細胞癌的發生[2]。目前，T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子 -3（T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3,Tim-3）和程序性死亡受體 -1（programmed cell death protein 1,PD-1）在免疫細胞表面的廣泛表達成為對HBV相關性肝病研究的熱點之一。PD-1有2個配體，即PD-L1和PD-L2。PD-1可廣泛表達于活化的T淋巴細胞、單核細胞、DC等細胞表面，但在NK細胞表面一般不表達或低水平表達。研究結果顯示[3]，PD-1在病毒感染、免疫性疾病及腫瘤免疫逃逸中發揮調控作用，PD-1在與其配體結合后可降低T淋巴細胞表面受體介導的抗原信號強度，進而發揮免疫負性調控作用。PD-1通過調控免疫應答來調控過度、持久的免疫反應，進而減輕機體組織的免疫損傷，但這種免疫抑制作用可衰竭CD8+T細胞的數量與功能，造成機體對病原體的清除能力下降和病原體的持續表達[4]。研究表明，Tim基因共有8個，編碼4種蛋白，在人類編碼3種蛋白Tim-1、Tim-3和Tim-4中，Tim-3是一種適應性免疫負性調節因子，廣泛表達于活化的T淋巴細胞、單核細胞及NK細胞，通過與Tim-3配體結合參與免疫反應的調控作用[5]。Tim-3在T淋巴細胞表面表達失衡與HBV感染者自身免疫功能紊亂等關系密切[6]。為此，本研究通過檢測HBV相關性肝病患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）表面 Tim-3、PD-1表達水平來探討Tim-3、PD-1在其發生、發展過程中的相關性，為HBV相關性肝病患者臨床免疫治療提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1～12月川北醫學院附屬醫院HBV相關性肝病患者120例為觀察組。診斷標準參照2015年中華醫學會肝病學分會制定的慢性乙型肝炎防治指南[7]。觀察組中，HBV攜帶者20例（HBV攜帶組）。其中，男性12例，女性8例；年齡18～66歲，平均（38.122±15.607）歲。CHB患者30例（CHB組）。其中，男性25例，女性5例；年齡18～68歲，平均（39.260±14.981）歲。重型乙型肝炎患者20例（重型乙型肝炎組）。其中，男性13例，女性7例；年齡18～60歲，平均（37.766±15.450）歲。乙肝肝硬化患者30例（乙肝肝硬化組）。其中，男性19例，女性11例；年齡18～61歲，平均（38.981±15.232）歲。肝細胞癌患者20例（肝細胞癌組）。其中，男性14例，女性6例；年齡18～67歲，平均（39.975±14.550）歲。以該院同期的20例HBsAg（-）健康體檢者為健康對照組。其中，男性12例，女性8例；年齡18～64歲，平均（37.980±14.418）歲。觀察組與健康對照組在年齡、性別構成比等方面差異無統計學意義（P ＞0.05）。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①患者需知情同意；②HBV感染后肝病診斷需符合中華醫學會制定的2015年版的慢性乙型肝炎防治指南標準；③入院時未接受免疫調節與抗病毒治療。排除標準：①合并其他嗜肝病毒感染及其他原因所致的肝組織炎癥；②合并其他疾病。

1.3 儀器與試劑

ADVIA 2400型全自動生化分析儀購自美國Beckman-Coulter公司，BIO-Rad實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，FACS Calibur流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。HBV感染標志物試劑盒購自美國雅培公司，PBS溶液購自美國Hyclone公司，多聚甲醛試劑盒購自美國Sigma公司，PD-1試劑盒購自美國eBioscience公司，鼠抗人Tim-3-PE熒光素標記單克隆抗體購自美國BioLegend公司，肝功能檢測試劑盒購自上海藍怡科技有限公司。

1.4 檢測方法

1.4.1 PBMCs分離采用 Ficol-Hypaque 密度離心法分離PBMCs，取有肝素鈉抗凝采血管采集患者空腹全血并離心后去血漿，然后用PBS稀釋一倍，加至淋巴細胞分離液上層，2 500 r/min 離心 25 min，取中間白膜層（單核細胞和淋巴細胞富集層），PBS再洗滌2次可獲取PBMCs。

1.4.2 PBMCs表面PD-1 表達水平檢測 取 3 MIU PBMCs 加入 40 μl FcR Blocing Rergent，4℃避光孵育20 min，以流式洗液洗滌細胞1次，加入lin 1-FITC、HLA-DR-perCP、CD11c-APC，PD-L1-PE或其相應的同型流式著色，4℃避光孵育20 min，用流式洗液洗滌細胞1次，用1%的多聚甲醛溶液固定，mDCs表面特征性標志為 CD11c high HLA-DR lin-1。

1.4.3 PBMCs表面Tim-3 表達水平檢測 取 3 MIU PBMCs加入流式CD16、CD56和Tim-3以及單標和同型對照標志物，取4%多聚甲醛溶液500 μl固定后上機檢測。

1.4.4 HBV感染標志物及肝功能檢測 HBV 感染標志物的檢測采用化學發光法；實時熒光定量PCR檢測血清HBV DNA水平；采用ADVIA 2400全自動生化分析儀檢測肝功能指標。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson分析PD-1、Tim-3與其他指標間的關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平比較

健康對照組外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平最低，與HBV攜帶組比較差異無統計學意義（P ＞0.05），隨著病情加重，其PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平逐漸升高，在重型乙型肝炎組、肝細胞癌組中最高，各HBV相關性肝病患者組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平與健康對照組、HBV攜帶組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 HBV相關性肝病患者PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平與HBV DNA載量、ALT、AST表達水平的相關性分析

HBV相關性肝病患者PBMCs表面Tim-3表達水平與 HBV DNA 載量呈負相關（P＜0.05），與 ALT、AST水平均呈正相關（P＜0.05）；HBV相關性肝病患者PBMCs表面PD-1表達水平與HBV DNA載量呈負相關（P＜0.05），與 ALT、AST 水平呈正相關（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平的相關性分析

HBV相關性肝病患者總體PBMCs表面Tim-3的表達水平與PD-1表達水平呈正相關（r =0.967，P =0.000）。重型乙型肝炎、CHB、乙肝肝硬化患者PBMCs表面Tim-3表達水平與PD-1表達水平差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表1 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平比較（ng/ml，±s）

表1 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平比較（ng/ml，±s）

注：?與健康對照組、HBV攜帶組比較，P＜0.05。

組別 n Tim-3 PD-1健康對照組 20 1.675±0.488 8.330±0.965 HBV攜帶組 20 1.735±0.442 8.360±4.102 CHB組 30 6.907±0.645? 44.460±5.995?乙肝肝硬化組 30 8.890±1.189? 59.267±7.422?重型乙型肝炎組 20 11.410±3.037? 68.335±5.724?肝細胞癌組 20 11.210±1.998? 68.340±9.147?F 值 649.651 1 617.655 P值 0.000 0.000

表2 HBV相關性肝病患者PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平與HBV DNA載量、ALT、AST表達水平的相關性分析

表3 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平的相關性分析

3 討論

HBV相關性肝病患者存在特異性免疫功能紊亂或處于免疫耐受狀態，導致機體不能及時清除HBV而發生感染慢性化，激活的特異性淋巴細胞才能清除HBV，樹突狀細胞的抗原呈遞作用是激發免疫反應發生的重要環節[8-9]。HBV相關性肝病患者的發病主要通過對肝細胞的免疫損傷來完成，機體免疫調節主要通過T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞等及其分泌的細胞因子來實現，而CD4+T淋巴細胞和CD8+T毒性T淋巴細胞數量和功能改變影響著HBV相關性肝病患者機體的免疫應答能力。研究結果顯示[8]，T淋巴細胞表面存在雙信號通路，在受到HBV等信號刺激后被激活：①T細胞識別樹突狀細胞的MHC及MHC結合的抗原肽產生第一信號；②T細胞的受體CD28與樹突狀細胞上的B7結合產生第二信號，即共刺激信號，是T細胞抗原特異性激活的關鍵信號通路。在多共刺激信號通路中，負向協同的共刺激分子PD-1在與其相應配體結合后，抑制T細胞增殖、活化與分化。Tim-3在HBV感染后的HBV相關性肝病患者中發揮著對免疫功能負向調控作用，Tim-3與半乳糖凝素-9結合，為T淋巴細胞提供負性共刺激信號受體與信號通路，介導Th1細胞凋亡或抑制Th1細胞活性，從而降低促炎因子產生，同時通過對Th17細胞的抑制達到調控適應性炎癥反應[6]。

本研究結果顯示，HBV相關性肝病患者PBMCs表面Tim-3的表達水平與HBV DNA載量呈負相關，與ALT、AST表達水平呈正相關，HBV相關性肝病患者PBMCs表面PD-1的表達水平與HBV DNA載量呈負相關，與ALT、AST表達水平均呈正相關。與王琳等[1]研究結果相似。安仲武等[10]的研究結果中顯示，在ALT＞2×ULN，Tim-3表達水平升高，提示機體免疫細胞分泌的促炎因子可能處于較高的表達水平，PBMCs誘導分泌的促炎因子Tim-3、PD-1的表達水平也增加，表明Tim-3、PD-1參與誘導、促進HBV相關性肝病患者炎癥反應過程所致的肝細胞損傷。

本研究資料結果顯示，健康對照組外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平最低，與HBV攜帶組比較差異無統計學意義，隨著病情加重，其PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平逐漸升高，在重型乙型肝炎組、肝細胞癌組水平最高，各HBV相關性肝病患者組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平與健康對照組、HBV攜帶組比較差異有統計學意義。表明Tim-3、PD-1高表達與機體感染HBV后的炎癥和纖維化程度相關，且PBMCs表面Tim-3、PD-1的表達水平與HBV相關性肝病患者病情程度呈正相關，提示Tim-3、PD-1參與肝組織炎癥的發生、發展過程，表明CHB患者外周單核細胞Tim-3上調可能參與HBV感染慢性化過程，可為HBV感染患者的免疫治療提供一定理論基礎，這與其他學者研究結果相似[11]。NEBBIA等[12]實驗結果提示，阻斷PD-1通路可減輕肝組織炎癥程度和阻止肝組織肝纖維化的發生，在阻斷Tim-3/天然配體半乳糖凝素-9通路后，可對增強HBV特異性T淋巴細胞免疫應答反應起到明顯調控作用，表明Tim-3、PD-1兩條信號通路對機體的免疫抑制具有協同作用。本研究發現，HBV相關性肝病患者PBMCs表面Tim-3與PD-1表達水平呈正相關，提示負性共刺激因子Tim-3和負向的協同共刺激分子PD-1間具有高度的協同性，可相互協同促進、參與HBV感染后相關性肝病患者體內的炎癥反應的發生與免疫逃逸過程，同時增強機體的免疫耐受能力。

本研究發現，HBV相關性肝病患者PBMCs表面Tim-3表達水平與HBV DNA載量呈負相關，PD-1表達水平與HBV DNA載量也呈負相關。這與趙小瑜等[11]研究結果相似，提示CHB患者Tim-3表達水平與HBV DNA載量呈負相關，PD-1的表達水平與血清HBV DNA載量呈負相關，但差異無統計學意義。NEBBIA[12]在對18例接受抗乙肝病毒治療的CHB患者研究發現，PD-1表達水平與HBV DNA載量呈正相關，在抗病毒治療后患者外周血PD-1水平下降明顯。同時PENG等[13]研究發現，CHB患者HBV特異性CD8+T淋巴細胞表面PD-1水平與HBV DNA載量呈正相關。本研究結果提示，HBV相關性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平高低與HBV DNA載量呈負相關，表明Tim-3、PD-1表達水平可能會影響HBV DNA的復制，筆者認為，通過調節Tim-3、PD-1表達水平可能會對HBV相關性肝病患者肝組織的炎癥程度有一定調控作用，甚至也可能對HBV DNA水平或肝組織纖維化發生有一定調控作用。

綜上所述，HBV相關性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達水平具有差異，其表達水平變化與病情進展關系密切，PBMCs表面Tim-3、PD-1高表達可能會降低免疫細胞的免疫狀態，誘發免疫耐受，從而使病情呈慢性化發展，在干預Tim-3、PD-1作用靶點后的肝組織炎癥與纖維化程度改變如何，尚需進一步研究證實，這為HBV相關性肝病患者臨床免疫治療提供了一種新思路。