槐花黃酮磷脂復合物制備及其對植物油氧化穩定性的影響

蔣新龍 郭葉瑩 吳小剛 陳品品 葉小霞 蔣益花

(浙江樹人大學生物與環境工程學院，杭州 310015)

食用植物油中含有較多的不飽和脂肪酸，其中包括油酸(C18 ∶1)、亞油酸(C18 ∶2)以及亞麻酸(C18 ∶3)，在加工、儲藏以及銷售過程中極易出現氧化酸敗現象。油脂發生氧化所生成的氧化物不僅影響其營養價值、口感、風味，且會對癌癥等多種疾病產生誘發作用[1-2]。延緩油脂氧化酸敗的一種有效方法是添加抗氧化劑[3-4]。

黃酮類化合物除具有通常的抗菌、抗癌、抗炎和抑制脂肪氧化酶等生物活性外[5-7]，還具有很強的抗氧化性，在油脂抗氧化方面有顯著效果[8-10]。但黃酮含有多個極性基團，分子極性大，其親水性較強，故在油中的溶解度和界面分散性能不是很好，因此大大抑制了黃酮在抗油脂氧化中的應用。有學者研究發現，黃酮與磷脂之間具有特殊的親和力，通過制備磷脂復合物，可以提高黃酮的脂溶性[11]。本研究采用超聲-微波協同技術，以槐花黃酮為原料制備黃酮磷脂復合物，利用正交設計對制備工藝條件進行優化，并初步探索黃酮磷脂復合物對植物油抗氧化的影響，旨在為槐花黃酮的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槐花：50 ℃鼓風干燥72 h，粉碎過60目篩，備用；植物油為新鮮精煉核桃油和葡萄籽油；大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿98%)；蘆丁；其他試劑均為分析純。

CW-2000型超聲-微波協同萃取/反應儀、D8017TL-2H型格蘭仕微波爐、布魯克TENSOR27 紅外光譜儀、島津UV2450紫外可見分光光度計、UV-1600型紫外可見光譜儀、FW100 型高速萬能粉碎機、AB204-N 型分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 槐花黃酮的制備和含量測定

槐花黃酮的制備：本實驗室采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相的方法對槐花中黃酮進行提取，并用大孔樹脂柱進行純化。具體方法：以磷酸氫二鉀質量濃度117 mg· mL-1、54%乙醇溶液組合的乙醇-磷酸氫二鉀雙水相萃取體系，液料比60 ∶1(V/m)、微波提取時間30 s、微波功率為648 W等條件下，得到上相；將上相減壓濃縮得到的濃縮液調至pH值為6，過D-101大孔樹脂柱，用75%乙醇溶液洗脫，得到洗脫液，再對洗脫液進行減壓濃縮，冷凍干燥，得到純度高達90%的槐花黃酮，待用。

黃酮含量的測定：采用紫外分光光度法測定黃酮得率[12]，得到蘆丁質量濃度C(mg· mL-1)與吸光度A之間的關系式為：A=28.289C+0.037 2，其線性范圍為0.00～0.10 mg· mL-1，相關系數R2=0.994 7。待測樣品同法在360 nm處測定吸光值，根據回歸方程計算黃酮含量。

1.2.2 黃酮磷脂復合物制備實驗

制備方法：取一定量黃酮，置于100 mL 儀器專用萃取瓶中，加入適量無水乙醇配成一定黃酮質量濃度，再按黃酮與磷脂的反應投料比加入磷脂，攪拌使樣品良好分散于無水乙醇中。將萃取瓶放于儀器萃取爐腔中，安裝好冷凝回流裝置，分別設置微波功率、反應時間等參數，檢查完畢后開啟微波及超聲(固定超聲條件：超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz，開啟超聲)進行反應。反應一定時間后，減壓除去無水乙醇，再加入少量的三氯甲烷溶解其中的磷脂及復合物，溶解后進行抽濾，滴加少量的三氯甲烷洗滌固體至只剩下未反應的黃酮，收集沉淀，干燥后稱重W，同時濾液再次減壓干燥，蒸干所得物即為黃酮磷脂復合物。黃酮的初始投料量與沉淀量的差值即為與磷脂復合的黃酮的量，從而計算黃酮與磷脂的復合率。

式中：W0為黃酮初始投入量;W為黃酮沉淀量。

單因素實驗：按照1.2.2提取方法，固定初始條件其他量不變，采用控制變量法，考量黃酮質量濃度、投料比(磷脂與黃酮的質量比)、反應時間和微波功率等因素對復合率的影響。超聲條件固定(超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz)，分別設置投料比梯度2 ∶1、1 ∶1、1 ∶1.5、1 ∶2、1 ∶2.5；黃酮質量濃度梯度1、2、3、4、5 mg/mL；反應時間梯度10、20、30、35、40 min；微波功率梯度100、200、300、400、500 W。

正交優化實驗：在單因素試驗的基礎上，選擇黃酮質量濃度、反應時間、微波功率、投料比4個因素為主要變量，以復合率為指標，采用 L9(43)進行正交試驗。

1.2.3 黃酮磷脂復合物的理化性質實驗

紫外分析：將一定量的黃酮以及黃酮磷脂復合物分別溶于無水乙醇溶液中，制成一定濃度的乙醇溶液；同樣方法制備一定濃度的磷脂乙醇溶液，將3種溶液進行紫外全波長掃描。

紅外分析：采用KBr壓片法分別對黃酮、磷脂及黃酮磷脂復合物在400～4 000 cm-1范圍內進行紅外掃描。

溶解度的測定：取20 mL溶劑(水、正辛醇)，分別加入過量的黃酮或黃酮磷脂復合物于室溫下攪拌6 h，取上清液過0.45 μm濾膜，測定其上清液濃度。

1.2.4 黃酮磷脂復合物對植物油抗氧化影響實驗

1.2.4.1 黃酮磷脂復合物植物油樣品液的制備

參照 GB 2760—2014中一般在植物油脂中加入天然抗氧化劑用量，本實驗黃酮磷脂復合物濃度梯度設置為 0.01%～0.06%。按設計所需的質量分數將適量的黃酮磷脂復合物添加到植物油中，先超聲輔助溶解10 min，再磁力攪拌10 min，使黃酮磷脂復合物與植物油充分混勻，得到系列黃酮磷脂復合物植物油樣。

用所得到的系列黃酮磷脂復合物植物油樣，以油脂的過氧化值為衡量指標[13]，采用GB/T 5538—2005法測定過氧化值，先測定常溫下POV值，再測定98 ℃加熱 6 h 后POV值，根據加熱后過氧化值的相對大小，確定最佳添加量。

1.2.4.2 植物油表觀活化能測定

采用Schaal烘箱法[14]測定樣品POV隨貯藏溫度、時間的變化。將最佳黃酮磷脂復合物添加量的植物油置于碘量瓶中密封，分別置于45、55、65 ℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中。每隔2 d(共10 d)取樣，測定樣品POV0。

植物油的氧化符合一階動力學反應[15,16]，在植物油中添加抗氧化劑后植物油的氧化也符合一階動力學反應[17]。本研究在根據一級反應動力學方程ln(POV/POV0)=-kt，對不同時間t的POV進行擬合，得到回歸方程和相關系數，求得反應速率常數k。根據Arrhenius反應速率k與溫度T的關系經驗公式(lnk=lnk0-Ea/RT)，用lnk對1/T作圖，可得到一條斜率為-Ea/R的直線，由斜率可得表觀活化能Ea[18]。同法空白參照。

1.3 統計方法及分析軟件

以上指標均重復測定3次并取平均值，應用SPSS20.0軟件進行數據統計，利用Ori gin8軟件作圖，用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 黃酮磷脂復合物制備

2.1.1 單因素實驗

根據張勝海[19]、石森林[20]等研究結果和本團隊的預試結果，確定無水乙醇為反應溶劑。

圖1可知，在磷脂 ∶槐花黃酮質量比為2 ∶1時，磷脂復合物的復合率最高。投料比對復合率有較大的影響，復合率隨體系中磷脂比例的增加而增加。當磷脂 ∶槐花黃酮質量比為2 ∶1時，二者的相互作用最充分。

在反應物濃度為1～2 mg/mL時，磷脂復合物的復合率隨著黃酮濃度的增大而增大，當反應物濃度為2 mg/mL時，磷脂復合物的復合率最高。黃酮濃度對復合率有較大影響，黃酮濃度較小時，復合率較高。因為黃酮在溶液中須經碰撞才能發生反應，較高的濃度反而不利于反應的進行[21]。

在反應時間為10～35 min時，磷脂復合物的復合率逐漸增大，當反應35 min時，磷脂復合物的復合率最高。反應時間過長，微波的熱效應會使黃酮產生降解。

在微波功率為300 W時，磷脂復合物的復合率達到最大值。超聲-微波協同技術的最的優勢在于能同時充分利用微波的高能作用和熱效應以及超聲波的空化作用。隨著微波功率的增加，磷脂分子和黃酮的熱力學活動趨于活躍，有利于兩者之間的進一步結合。但微波功率過高，高能熱效應明顯，黃酮穩定性較差，不利于黃酮磷脂復合物的形成。且溫度過高也不利于磷脂復合物的穩定。

圖1 黃酮磷脂復合物制備條件單因素實驗結果

2.1.2 正交實驗結果及分析

表1為正交試驗的因子與水平。正交實驗結果見表2。

表1 4因子在3水平正交試驗的因子與水平

表2 正交實驗設計及結果

表3 方差分析表

注：因素D影響小，故作為方差分析的誤差處理；F0.05(2、2)=19.00，“*”表示因素影響顯著。

表2中k1、k2、k3表示每個因素所進行3次實驗所得的復合率的平均值。R為平均數的極差，R越大表明變化幅度大，說明該因素的水平變化對復合率的影響越大，該因素即是最大影響因素。由表2極差可以看出影響復合率的因素主次依次排列為：黃酮質量濃度(A)>投料比(B)>反應時間(C)>微波功率(D)。由表3可以看出，對復合率的影響主次依次排列為：黃酮質量濃度(A)>投料比(B)>反應時間(C)>微波功率(D)。方差分析和極差分析在復合率影響主次排列上完全一致。表3還可以看出，對復合率的影響黃酮質量濃度(A)和投料比(B)顯著，其他則不顯著。直觀分析，實驗的最優水平組合為A2B2C3D1；根據每個因素k1、k2、k3實驗的最優水平組合為A2B2C3D2。因為反應時間40 min與35 min、30 min差異顯著，微波功率三個水平之間無顯著差異，綜合分析提取成本和復合率，確定最佳工藝條件A2B2C3D1，即黃酮質量濃度2 mg/ mL，投料比1 ∶2 g/g，反應時間40 min，微波功率200 W。根據最佳工藝條件進行工藝驗證實驗，復合率為79.98%，與預測值無顯著差異。

2.2 理化性質實驗

2.2.1 光譜分析

紫外掃描如圖2所示。黃酮在 265、370 nm處有強烈吸收峰，這是由于黃酮具有共軛不飽和結構所致；卵磷脂沒有共軛結構，以致卵磷脂只有在215 nm處有紫外最大吸收峰出現；黃酮-卵磷脂復合物與黃酮在紫外圖譜中沒有顯著差異，且它們均在 265、370 nm處有強烈吸收峰，與黃酮一致。由此可知，黃酮與卵磷脂在形成復合物的過程中沒有產生新的共軛結構，它們僅僅是通過非共價結合。

圖2 紫外吸收光譜圖

圖3 紅外吸收光譜圖

由圖3可以知道，在黃酮的紅外圖譜中，約3 417 cm-1處代表的是羥基特征峰，隨后分別是羰基(1 647 cm-1)和苯環(1 516、1 286、1 196、1 132 cm-1)的特征吸收峰。黃酮和卵磷脂的復合物與黃酮的吸收光譜大致相同，黃酮和卵磷脂的特征吸收峰都可以在復合物的吸收光譜中找到，復合物的吸收光譜表現為黃酮和卵磷脂的吸收光譜的疊加。但黃酮在1 000～1 500 cm-1之間的大部分特征吸收特征峰變化比較大，表明黃酮和卵磷脂不是簡單的一種混合狀態，黃酮與卵磷脂發生了相互作用，但復合物在掃描范圍內是沒有出現新的吸收峰。由此說明，黃酮和卵磷脂在形成復合物的過程中并沒有形成新的共價鍵，黃酮和卵磷脂在復合物中仍然各自保留其基本的化學結構。

由紅外、紫外光譜分析初步看出在復合物中并無新的化學鍵生成。黃酮與磷脂的復合是一種弱的相互作用[21]，從結構上看，黃酮酚羥基上的氧具有負電性，磷脂帶有正電性的季胺氮，兩者可產生偶極-偶極作用力而使兩分子結合[22]，形成黃酮磷脂復合物。

2.2.2 溶解度測定結果

槐花黃酮是極性化合物，在油脂中的溶解性極低，而其與磷脂形成的包合物后在油脂中的溶解性可以得到提高。實驗結果表明，黃酮在 25 ℃正辛醇中的溶解度為 0.877 1 mg/mL；而黃酮卵磷脂復合物在正辛醇中的溶解度增加至5.582 7mg/mL，脂溶性增加了6.4倍，脂溶性得到顯著提高，可能是復合物中磷脂的極性基團與黃酮相互作用而受到一定的掩蔽，使得復合物表現出較強的脂溶性[23]。黃酮在 25 ℃水中的溶解度為 0.026 9 mg/mL；而黃酮卵磷脂復合物在水中的溶解度增加至0.513 3 mg/mL，水溶性增加了19.1倍，水溶性也得到了很大改善，可能是由于其在水中形成的類似脂質體的膠團結構的增溶作用[21]。實驗結果表明，磷脂復合物可改善黃酮的溶解性能。

圖4 槐花黃酮抗油脂氧化效果

2.3 槐花黃酮磷脂復合物對油樣的抗氧化效果

2.3.1 濃度對槐花黃酮磷脂復合物抗油脂氧化效果的影響

由圖4可知，添加槐花黃酮磷脂復合物后，葡萄籽油和核桃油的過氧化值均低于空白對照，說槐花黃酮磷脂復合物對葡萄籽油和核桃油具有抗氧化作用，且隨著其添加量的增加，植物油的過氧化值逐漸降低，抗氧化活性增強，對葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有劑量效應的關系。

表4 植物油過氧化值的回歸方程及活化能參數

注：y為ln(POV /POV0)；x為t。

2.3.2 溫度對槐花黃酮磷脂復合物抗油脂氧化效果的影響

本研究采用抗油脂氧化效果最好的0.06%槐花黃酮磷脂復合物進行Schaal烘箱加速氧化實驗。圖5為兩種植物油抗氧化穩定性在不同溫度、時間下的變化。由圖5可知，在45、55、65 ℃時，添加槐花黃酮磷脂復合物前后對葡萄籽油和核桃油的過氧化值變化趨勢大體相同。隨著溫度升高和加熱時間的延長，植物油的過氧化值逐漸升高，氧化速度加快。

圖5 植物油抗氧化穩定性在不同溫度、時間下的變化

根據1.2.3.2方法得到過氧化值的回歸方程。由表4可知，植物油的氧化反應屬于一級反應，其回歸系數R>0.97，擬合度高，與周嬋玉等研究結果一致[17]。且隨著溫度升高，氧化速率增大。

根據1.2.3.2方法得到表觀活化能。表4可知，添加槐花黃酮磷脂復合物后植物油的活化能明顯升高，說明添加槐花黃酮磷脂復合物的植物油的氧化反應較難進行。由于槐花黃磷脂復合物所含的酚類結構，可提供氫原子，使自由基轉化為穩態的化合物，進而中斷自由基反應[24]，提高了相應植物油的抗氧化性。

表4同樣表明，核桃油表觀活化能增大百分率比葡萄籽油大，說明槐花黃酮磷脂復合物對核桃油的抗油脂氧化效果更有效，主要原因是跟核桃油與葡萄籽油含有不同的脂肪酸成分有關[25]。核桃油比葡萄籽油亞麻酸含量高，多不飽和脂肪酸含量比葡萄籽油高。有試驗表明，亞麻酸含量對油脂氧化影響遠大于亞油酸含量的影響，且亞麻酸氧化速度為亞油酸的兩倍[26]，含多不飽和脂肪酸油脂的氧化敏感性較高[25]。所以槐花黃酮磷脂復合物對核桃油的抗油脂氧化效果比葡萄籽油更有效。

3 結論

以槐花黃酮為原料，以復合率為衡量指標，采用超聲-微波協同技術制備黃酮磷脂復合物，利用正交設計對制備工藝條件進行優化。最佳制備工藝為：無水乙醇為反應溶劑，磷脂與黃酮的投料比1 ∶2 g/g，黃酮質量濃度2 mg/mL，微波功率200 W，反應時間40 min，此制備條件下，黃酮磷脂復合物復合率為79.98%。

紅外光譜和紫外光譜分析表明，黃酮與卵磷脂在形成復合物的過程中沒有產生新的共軛結構，它們僅僅是通過非共價結合。磷脂復合物可改善黃酮的溶解性能，水溶性增加了19.1倍，脂溶性增加了6.4倍。

抗氧化實驗結果表明，槐花黃酮磷脂復合物對葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有劑量效應的關系。在植物油中添加黃酮磷脂復合物后植物油的氧化符合一階動力學反應。添加黃酮磷脂復合物后植物油的氧化反應活化能較大，添加黃酮磷脂復合物可以延緩葡萄籽油和核桃油的氧化反應。核桃油表觀活化能增大百分率比葡萄籽油大，槐花黃酮磷脂復合物對核桃油的抗油脂氧化效果更好。本研究為槐花黃酮的進一步資源化開發利用提供了一定的技術支撐。