根癌農桿菌介導單子葉植物遺傳轉化研究進展

楊靜

摘 ? 要：在植物遺傳轉化研究的進展中，因根癌農桿菌具有轉入的外源DNA結構完整、外源基因表達比較穩定、經濟簡便、技術儀器要求低等優勢，成為了目前應用較為廣泛的轉基因技術。對根癌農桿菌介導單子葉植物的發展狀況、影響因素和提高轉化效率進行了綜述，以期為提高單子葉植物遺傳轉化效率和轉化技術提供參考依據。

關鍵詞：根癌農桿菌;單子葉植物;遺傳轉化;研究進展

將農桿菌作為載體成功獲得轉基因煙草的試驗發生在1983年，其后的30多年，農桿菌介導的遺傳轉化技術在雙子葉植物的研究中得到了長足發展。之后，關于單子葉植物在這方面的研究卻比較少，因為農桿菌寄主范圍局限于雙子葉植物和一些裸子植物。單子葉植物被認為不能作為農桿菌的宿主，所以難以被轉化。因此最初人們關于單子葉植物通過根癌農桿菌介導遺傳轉化的研究很少，而多是采用PEG法、基因槍法及電激法等。

1 ? 根癌農桿菌轉化單子葉植物的研究進展

1.1 ? 水稻

水稻作為單子葉植物研究的模式植物，關于根癌農桿菌介導水稻遺傳轉化的研究開始得比較早。水稻的遺傳轉化研究從完全否定其可行性，到可以進行轉化，從低頻率轉化到高頻率，經過幾十年的研究發展，已經具備了相當的理論基礎和研究成果，實現了許多優質的外源基因對水稻的遺傳轉化[1]。

李寶健證明了水稻是可以通過農桿菌進行遺傳轉化的，并獲得了轉基因的水稻，雖然其轉化頻率很低，卻是農桿菌介導轉化單子葉植物的一大突破。這之后，Hiei證明了水稻是可以被有效侵染的，他不僅利用胚性愈傷組織作外植體，還將粳稻的轉化頻率提高到28.3%，并建立了水稻的遺傳轉化體系。王春萍等[2]將ThIPK2基因通過農桿菌介導法插入到秈稻科恢675中，經驗證后，通過該試驗結果完善了優良的遺傳轉化體系。張燕紅等[3]利用農桿菌介導法，將SiPEBP基因轉入到秋田小町、新稻 21 號以及08GY30-5-4這3個新疆品種水稻中，試驗結果表明，3個品種的抗性愈傷率皆達到了40%以上。

1.2 ? 玉米

玉米作為三大糧食作物之一，是作為單子葉植物研究的重要對象。1996年，Ishida等[4]選用玉米自交系A188幼胚作為受體的轉基因試驗，獲得了世界上第一株用該方法轉化的轉基因玉米，從而證實玉米是能夠被轉化的，為玉米的遺傳轉化研究提供了一定的理論基礎。

邢小龍等[5]將 GUS作為目的基因，以玉米雜交種“鄭單958”為材料，以Bar作篩選標記，試驗結果表明，在侵染濃度0.6、侵染時間2 h、真空處理時間10 min的條件下，“鄭單958”作為受體能有效提高轉化效率。李曉麗等[6]將大豆鐵蛋白ferritin作為目的基因，通過農桿菌介導成功地將其目的基因轉入了玉米319莖尖組織中，從而使外源基因能夠轉入玉米之中，使該玉米具有了除草的抗性。

1.3 ? 小麥

小麥是三大谷物之一，也是人類的主食之一，將其磨成面粉可以制作各種食品，也可用于制作酒類，還可制成生物質燃料。對小麥進行遺傳轉化研究，對提高其產量和品質具有重要的意義。

世界上第一株用根癌農桿菌介導法轉化的小麥誕生于1997年。Cheng等[7]利用35S啟動子、HSP70內含子組成農桿菌載體，將其插入到小麥中，最終轉化率為4.3%，其轉化效率還比較低，但隨著研究深入以及轉基因技術的發展，通過根癌農桿菌介導轉化小麥的研究也日趨完善。

鄧萬銀等將致瘤農桿菌插入到處于抽穗期小麥的葉鞘基部和穗莖中，經過21 d，小麥出現瘤狀組織，該瘤狀組織中有冠痰堿，并且在試驗中加入乙酸丁香酮，可以增大瘤狀組織和提高出現頻率。Hess等利用根癌農桿菌介導法將農桿菌注入到處于花期小麥穗的小穗中，并用收獲的種子進行后續萌發試驗，得到了卡那霉素抗性植株，該試驗證實了nptⅡ基因可以整合到小麥中并得到穩定的遺傳。Xu等用酚類化合物對農桿菌作預處理，然后再用處理過的農桿菌侵染小麥的懸浮系細胞，得到了抗性愈傷組織，但數量較少，而且沒有再生植株。郭麗等[8]通過根癌農桿菌介導法，將小麥成熟胚作為受體，得到了再生植株，其中3株經過報告基因GUS的PCR檢測，均為陽性，并建立了相應的小麥遺傳轉化體系。

2 ? 影響農桿菌轉化單子葉植物的因素

2.1 ? Vir基因誘導物

農桿菌感染雙子葉植物時會發出信號，植物的受傷部位會產生乙酰丁香酮等物質，這些物質會誘導Vir基因，從而促進T-DNA基因向雙子葉植物細胞轉移。而單子葉植物則不同，在受到外部傷害時，細胞會出現木質化和硬化現象，無法產生乙酰丁香酮等物質，因此許多單子葉植物并不是農桿菌的有效宿主。

水稻得以通過農桿菌介導法成功轉化，一個很關鍵的原因是在轉化過程中加入了100 μmol/L的乙酰丁香酮，使得農桿菌更加容易侵染水稻的愈傷組織[9]。Chan等[10]將馬鈴薯種的細胞懸浮液添加到培養基中共培養，也起到了提高轉化效率的作用，這是因為馬鈴薯的細胞懸浮液中含有大量的酚類化合物，有助于激活Vir基因，幫助轉化。

2.2 ? 農桿菌菌株及載體系統

在將目的基因植入到受體過程中，農桿菌菌株的選擇以及高效的載體系統至關重要。Hiei等[11]用了雙元載體的方法，將菌株A281的Ti質粒上的VirBEG基因復制到雙元載體，從而造就了超雙元載體，最后結果顯示水稻達到了高頻率轉化。在農桿菌介導轉化單子葉植物的試驗中，常用的超毒力菌株通常有EHA101、EHA105以及AGL-1等。劉巧泉等[12]在之后的試驗中也發現，對于攜帶質粒pCAMBIA1301的農桿菌，EHA105的敏感度要明顯高于LBA4404和AGL-1，是轉化水稻十分高效的菌株。

2.3 ? 篩選劑的選擇

卡那霉素可作為篩選劑，但是在轉基因愈傷組織的篩選中作用不明顯，而且篩選后的愈傷組織很多不能再生出綠色植株。Toriyama等[13]選擇氨基糖苷類抗生素——G418作為篩選劑，該抗生素在篩選作用上更為高效，且不會像卡那霉素一樣使經過篩選的愈傷組織失去再生綠色植株的能力。霉素磷酸轉移酶基因（hpt）也是常用的篩選劑，它對氨基糖苷類抗生素——潮霉素B（Hyg）有著明顯的抗性表達，能更加清楚地分辨未轉化與已轉化的組織，且不會導致白化、不育等現象的發生。

2.4 ? 單子葉植物的外植體和基因

在根癌農桿菌介導法對單子葉植物的轉化中，受體本身的狀態和遺傳背景也是影響轉化的因素。雖然同為單子葉植物，但是不同的類別和品種在基因組合、生長狀態、生存環境、生理代謝等方面必然也有所不同，不同的細胞甚至相同細胞在不同的狀態下對根癌農桿菌的敏感性是不同的，同樣，農桿菌對它們的感染性也存在著差異。植物受傷時會分泌出酚類物質，該物質的主要功能是激活農桿菌Ti質粒上的毒性區，以誘導轉化，因此，外植體的選擇對農桿菌轉化單子葉植物有著很大的影響，選擇合適的外植體，有助于提高轉化效率。

易自力[14]的研究發現，農桿菌對不同品種水稻的敏感性是不同的，如粳稻品種臺北309和稻品種特青，對3種菌株的瞬時表達率平均值分別為55.5%、34.8%，存在顯著差別。葉興國等[15]在農桿菌介導轉化小麥的試驗中，對35個小麥品種作了比較，其中的兩個品種對農桿菌有較強的敏感性，分別是新春9號和PM97034。

3 ? 提高轉化效率的對策

3.1 ? 添加表面活性劑

表面活性劑可以提高細胞膜的通透性，便于農桿菌對受體的侵染，加快T-DNA基因由農桿菌向受體的轉移速度，以提高轉化效率。表面活性劑在農桿菌介導轉化單子葉植物中的主要功能包括：一是其雙親結構對有機物有著較強的吸引力;二是其分子在濃度較低的情況下可以吸附于兩相界面，從而緩解界面張力，讓分散的系統逐漸穩定。表面活性劑可分為離子型、非離子型兩類，其中非離子型的表面活性劑對受體造成的傷害小，且毒性弱，故應用較為普遍。

Cheng在農桿菌介導小麥轉化的試驗中添加了表面活性劑，結果表明，添加一定濃度的Silwet和PluronicF-68的表面活性劑有助于提高農桿菌的侵染效果和促進外源基因的轉移。但相對地，在培養液中加入濃度很低的Tween20、TritonX表面活性劑則有反作用，會為害小麥的愈傷組織。Chhabra等[16]在轉化小麥的研究中，加入了0.2% Tween20的表面活性劑處理農桿菌侵染液，從而提高了小麥愈傷組織的轉化效率，但表面活性劑一旦高于該濃度，轉化植株的GUS瞬時表達率就會急劇下降。

3.2 ? 添加抗氧化劑

在根癌農桿菌介導轉化單子葉植物的試驗中，受體細胞在被侵染的過程中會產生逆境環境，繼而產生過氧化物，使受體細胞被氧化，導致愈傷組織在共培養階段褐化，阻礙組織分化。抗氧化物可以去除細胞內的活性氧成分，起到避免細胞被氧化的作用，減少共培養階段愈傷組織的褐化現象，促進農桿菌對受體的侵染，加快轉化。

于惠敏等[17]在轉化濟南177小麥試驗中發現，在培養過程中添加抗氧化劑二硫蘇糖醇（DDT）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），有助于轉化，當DTT的濃度在0.1%～0.15%，PVPP含量達到1.0%時，轉化效率最高，且DTT提高轉化效率的作用要明顯高于PVPP。除此之外，AgNO3、半胱氨酸（Cys）、抗壞血酸（Vc）等抗氧化劑都能起到保護細胞不被氧化的作用，其中AgNO3的應用范圍較廣，對組織褐化有明顯的阻礙作用。

3.3 ? 整株轉化

“整株培養”技術是將外源基因以裸露DNA的形式直接或通過農桿菌介導轉入到完整的植株中，完成基因的轉移。在農桿菌介導轉化單子葉植物的試驗中，組織培養的步驟繁多，而且十分耗費時間，已轉化的組織還容易發生體細胞克隆變異（somaclonalvari-ations）和嵌合體（chimera）等現象。“整株轉化”可以減少組織培養的步驟。“整株培養”技術在擬南芥研究上取得了巨大的成就。在水稻遺傳轉化的研究中，幼胚和幼穗經過預培育得到的愈傷組織可作為轉化對象，不同的是，幼胚的預培育時間在3～5 d，而成熟胚盾片的預培育時間卻長達30～50 d，使用幼胚培育可大大縮短試驗時間。

4 ? 結語

經過國內外學者的常年努力，根癌農桿菌介導單子葉植物遺傳轉化的研究從無到有、由淺入深、由點及面，研究體系、研究方法逐漸豐富，在許多領域取得了豐碩的成果，改良了許多單子葉植物的基因，提高了水稻、小麥、玉米的品質和產量。但與雙子葉植物的研究相比，還存在著較大的差距，如可轉化的種類有限、轉化效率不高等，有待進一步深入。此外，根癌農桿菌介導單子葉植物的遺傳轉化在實踐應用上也還不夠廣泛，轉基因植物的推廣，對種植業、畜牧業甚至工業方面的發展都有十分重要的意義，隨著轉基因技術的發展和推廣，其經濟效益和社會效益都會日趨顯現。

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（收稿日期：2019-09-30）