新型骨髓誘導支架對骨髓間充質干細胞成骨分化的體外評價

陳碩 陳昌禮 陳玲

【摘 ?要】背景：以往研究已經證實，脫鈣骨基質（Demineralized bone matrices， DBM）是骨修復重建一種很好的選擇。然而，DBMs有限的骨誘導能力不足以更好地修復骨缺損。成骨細胞（Osteoblasts， OBs）是骨組織的主要細胞成分，在新骨的形成中起著重要作用。 OB的細胞外基質（extracellular matrix， ECM）是骨形成的主要成分之一。目的：本研究的目的是將DBM與OB的ECM相結合，以構建可用于骨重建的新型支架材料。方法：本研究將OBs在DBMs的表面上培養10天后制備OBs-ECM-DBMs（OEDBMs）。評估了一系列材料特征，例如OB和ECM的殘留，OEDBMs的細胞毒性和骨誘導能力。結果：在OEDBMs中觀察到較低的細胞殘留和較低的DNA含量。與DBM相比，OEDBM具有更多的骨組織有機基質蛋白，如骨鈣蛋白，骨橋蛋白和膠原蛋白I。當在兩種材料上培養時，大鼠骨髓間充質干細胞（rBMSC）都具有良好的生存能力。與DBMs組相比，OEDBMs組中rBMSCs的成骨基因明顯上調。結論：上述結果表明OEDBMs用于骨組織工程中，具有很好的使用前景。

【關鍵詞】細胞外基質;骨誘導性;去礦質骨基質;骨髓間充質干細胞;成骨分化

【中圖分類號】R68???????【文獻標識碼】A??????【文章編號】1004-7484（2019）07-0116-02

引言

骨缺損是臨床常見的問題。由于脫鈣骨基質（demineralized bone matrices， DBMs）具有較好的骨誘導潛能，其已成為修復骨缺損的研究熱點^[1]。然而在臨床骨缺損修復過程中，常常發現單獨使用DBM的效果十分有限^[2]。在更多的研究中，DBM通常與人體外源性細胞因子聯合作用于骨缺損的修復^[3]。然而，單個細胞因子對于骨形成并無特異性^[4]。已有的研究報道了特定細胞外基質（extracellular matrix， ECM）對干細胞分化的影響作用^[5]。作為骨骼的主要細胞成分，成骨細胞（osteoblasts， OBs）在骨骼發育中起著重要作用^[6]。OBs可以分泌大量有機基質，如I型膠原（ collagen type I， COL I），骨橋蛋白（osteopontin， OPN）和骨鈣素（osteocalcin， OCN）等，這些胞外基質成分已被證實與新骨形成有著十分緊密的聯系^[7]。因此，我們提出本研究的假設，OB所分泌的特定ECM是否能作為一種表面修飾的手段，從而增強DBM的成骨誘導潛能。為了驗證該假設，我們制備了ECM修飾后的DBM（OBDBMs），并評價了其一系列生物學特征，包括OBDBM所保留的基質蛋白，細胞相容性以及其對于大鼠骨髓間充質干細胞（rat bone mesenchymal stem cells， rBMSCs）成骨分化的影響。

1?材料和方法

1.1 DBM的制備

根據已有的研究方法^[8]，我們制備了來源于牛皮質骨的DBM。步驟如下：將骨條在室溫下置于0.6M HCl中處理72小時，得到DBM。然后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌DBM數次，直至pH為中性。完成洗滌后，采用冰凍切片機將所有樣品切成200μm并凍干。進行后續細胞實驗之前，所有樣品均采用環氧乙烷進行滅菌。

1.2 修飾后DBM的制備

為了制備修飾后的DBM（OBDBM），本研究將OBs以4.0×10⁴個細胞/ cm²的濃度接種于DBM的表面，采用含10%FBS的DMEM培養。為了降低基質材料的免疫原性，在培養10天后，我們采用含有20mM 氫氧化銨的0.5%Triton X-100處理5分鐘（37℃），脫掉OB ^[9]再用PBS洗滌3次以除去試劑殘留物。

1.3 dsDNA檢測

為評價OBDBM中的細胞殘留情況，本研究將DBMs（n = 5），OBs-DBMs（n = 5）和OBDBMs（n = 5）的樣品剪碎，經金屬蛋白酶K消化后，采用酚抽提法獲得含有dsDNA的上清液。然后通過ds DNA試劑盒檢測DBMs，OBs-DBMs和OBDBMs的DNA含量。

1.4 細胞相容性評價

為了評估DBM和OBDBM的細胞相容性，將大鼠骨髓間充質干細胞（rBMSC）接種于兩種基質材料表面。分別于1天，2天，，3天采用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天，中國）對每組樣本行細胞毒性檢測。接種于孔板中的rBMSCs為對照組。

1.5 SDS-PAGE

為檢測OBDBM是否保留了部分OB分泌的ECM，本研究采用RIPA裂解液（碧云天，中國）提取了DBM（n=3）與OBDBM（n=3）的總蛋白。所提取總蛋白均通過BCA蛋白質測定試劑盒（碧云天，中國）定量后，與5×SDS-PAGE樣品上樣緩沖液（碧云天，中國）混合，并在100℃下加熱5分鐘，以使所有蛋白質變性。隨后，進行SDS-PAGE電泳。步驟如下：所有樣品均采用10%SDS-PAGE預制凝膠分離。電泳結束后，用考馬斯藍染色液對凝膠進行染色。采用凝膠成像儀（伯樂，美國）對DBM與OBDBM的蛋白條帶進行觀察和對比。

1.6 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction （RT-PCR）

為了評估OBDBM的骨誘導性，本研究將rBMSC（1.0×10^?5個細胞/ cm^?2）分別接種于DBM和OBDBM表面，培養7天。檢查rBMSCs中骨相關特異性基因的表達。本研究采用TRIzol提取各樣本的總RNA，并用一步法逆轉錄試劑盒（百奧萊博，中國）完成逆轉錄及PCR反應。相關特異性引物（表1），包括骨橋蛋白（osteonectin， ON），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）由生工生物科技合成（中國）。PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀（伯樂，美國）下觀察目的基因條帶。

2?統計分析

所有數據均以平均值±S.D（標準偏差）表示，并使用SPSS 22.0進行分析。對于兩組比較，應用雙尾two-tailed Student t檢驗。對于多組比較，應用單因素方差分析。 P <0.05則差異有統計學意義。

3?結果

3.1 脫細胞效果

三組（圖1）的DNA含量分別為19.70±2.40 μg/ ng（DBM），153.77±10.93 μg/ ng（OBs-DBM）和23.10±2.12μg/ ng（OBDBM）。與OBs-DBM相比，DBM和OBDBM均有較低的DNA含量（p <0.01）。結果表明，兩次脫細胞處理均成功地去除了細胞。

3.2 細胞相容性評估

在所有的檢測時間點，三組的rBMSC均表現出良好活力，隨著培養時間的延長，細胞增殖明顯（圖2），且組間未見顯著差異。這一結果表明兩種材料均具有良好的細胞相容性。

3.3 基質蛋白的保留評估

通過SDS-PAGE檢測DBM和OBDBM的總蛋白情況可以發現，在保證樣品上樣量相同的條件下，OBDBM比DBM呈現更多的蛋白質條帶（圖3）。在OBDBM中，可以在15kDa至170kDa的范圍內清楚地觀察到豐富的蛋白質條帶。相反，在DBM中僅顯示少量蛋白質條帶（> 40kDa）。這一結果表明OBDBM在低細胞殘留的情況下保留了豐富的ECM。

3.4 OBDBM的骨誘導潛力

為了評估OBDBM的骨誘導能力，我們分析了接種于DBM和OBDBM表面7天后，rBMSC的ON，RUNX2和ALP的表達水平。從結果來看，與DBM組相比，OBDBM組的ALP與ON的表達水平均顯著上調（圖4）。

4?討論

在本研究中，我們制備了OBDBM。它具有低細胞殘留，良好的細胞相容性，豐富的基質蛋白和更強的骨誘導潛力。

在OBDBM的制備過程中，存在兩個關鍵點：細胞殘留和ECM的保留。低免疫原性是良好支架的重要生物學特征。這種生物學特性依賴于有效的脫細胞處理^[10]。盡可能多的保留ECM可以部分模擬干細胞分化的特定微環境^[11]。本研究制備的DBM表現出非常低的細胞殘留，這與已有的相關研究結果一致^[12]。不同的是，在本研究中，我們為了讓OBs分泌的ECM與DBM共同模擬骨形成的微環境，將OBs接種在DBM的表面。在此過程中，OB顯示出優異的增殖能力并分泌豐富的ECM蛋白，但同時也再次帶來了免疫原性的風險，因此需要再次進行脫細胞處理。再次脫細胞處理后，H&E染色和DNA含量檢測的結果證明OBDBM中的細胞幾乎被完全除去。同時，SDS-PAGE結果顯示OB-ECM也被很好的保留了下來。

此外，細胞相容性也是本研究中OBDBM的生物學特性評價指標之一。以前的研究表明，DBM細胞毒性低，可以促進細胞增殖^[13]。在本研究中，MTT實驗的結果也證實了DBM和OBDBM具有相似的，良好的細胞相容性。

OBs分泌的基質蛋白被認為是骨發育的重要成員。通過SDS-PAGE發現DBM和OBDBM之間總蛋白有明顯的差異。 DBM僅保留了具有高分子量的蛋白質，從條帶位置來看，可以判斷DBM中主要是膠原蛋白，而OBDBM含有更為豐富的蛋白質條帶，具有更寬的分子量范圍。我們可以猜測OBDBM具有更多非膠原類蛋白，也正是這些大量的非膠原類蛋白模擬了骨發育的微環境。

BMSCs是一種多潛能的非造血骨髓細胞，通常被用作受損骨再生的種子細胞^[14]。以前的研究表明，在DBMs上培養的BMSCs有成骨分化的能力^[15]。值得注意的是，由于保留了大量的ECM蛋白，OBDBMs組在rBMSCs中表現出更高的ON和ALP表達水平。而這些基因是干細胞成骨的必需標志^[16]。因此，我們認為OBDBM在模擬骨發育微環境及促進干細胞成骨分化方面可能具有更大的優勢。

綜上所述，我們制備了OBDBM并證實了其具備一系列良好的生物學特性，如低細胞殘留，保存完好的ECM蛋白，良好的細胞相容性和更強的骨誘導性。然而，在這項工作中尚未分析植入體內后OBDBM的性能表現。因此，后續的研究將關注OBDBM用于骨缺損的修復的效果。

5?結論

本研究證實，OBDBM可保留較多的OB-ECM，具有低的細胞殘留。與DBM相比，對于rBMSC的成骨分化促進作用更強。因此，本研究認為OB-ECM可以用作修飾支架材料的工具，OBDBM也有望作為骨重建的生物支架應用于骨組織工程研究中。

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