無創DNA產前檢測技術的臨床應用研究進展

陳詠梅 王青云

【摘 ?要】染色體及基因異常是導致不孕不育、流產、早產、新生兒畸形的重要因素，其中以非整倍體染色體異常最為常見，例如21號染色體，18號染色體及13號染色體三體。核型分析及基因檢測是染色體疾病及基因病的診斷金標準，而羊膜腔取材為有創操作，風險大，周期長。母體外周血中胎兒游離DNA的發現使產前非侵入性診斷胎兒染色體疾病成為可能，近年來利用無創DNA非侵入性產前檢測技術篩查染色體疾病有了很大的發展，極高的靈敏度以及檢測成本的降低逐漸使無創DNA檢測技術成為孕期胎兒染色體疾病篩查的首選方法。本文重點綜述無創DNA產前檢測技術的臨床應用研究進展。

【關鍵詞】產前檢測;無創DNA;胎兒

【中圖分類號】R198??????【文獻標識碼】A??????【文章編號】1004-7484（2019）07-0139-02

【Abstract】Abnormal chromosome and gene could cause infertility， miscarriage， premature pregnancy， birth defects， and the chromosome aneuploidy abnormality is the most common， such as chromosome 21， 18 ，13 three body. Karyotype analysis and genetic testing are the diagnostic criteria for chromosomal diseases and genetic diseases， while the amniotic cavity is based on invasive operation， with a large risk and long cycle. The discovery of Cell-free fetal DNA in maternal peripheral blood made prenatal non-invasive diagnosis of fetal chromosomal disease possible.In recent years， the use of noninvasive DNA， a non-invasive prenatal detection technology， screening chromosome diseases has made great progress， high sensitivity and reduction of detection cost gradually make noninvasive DNA detection technology become the preferred method of fetal chromosomal disease screening pregnancy. This paper focuses on the progress of clinical application of noninvasive DNA prenatal testing techniques.

【Key words】Prenatal testing; Noninvasive DNA; Fetus

染色體及基因疾病是新生兒死亡及病殘的重要原因，這類患兒的出生給家庭及社會帶來了沉重負擔。絕大多數染色體及基因疾病無徹底根治的方法，只能通過孕期產前篩查及診斷避免這類患兒的出生。目前針對胎兒染色體及基因疾病的篩查方法包括血清學指標、侵入性產前診斷、無創產前檢測，其中血清學指標的檢出率較低，侵入性產前診斷雖被認為是產前診斷的“金標準”，但其操作復雜，流產及感染的風險較大。目前，采用無創DNA技術進行非整倍體染色體疾病的篩查檢出率高，對其他基因疾病篩查技術逐漸提高，具有操作方便、風險低的優點被大力推廣。

1 無創DNA產前檢測技術實現依據

我國的盧煜明教授譽為“無創DNA產前檢測”第一人，早在二十年前就在孕婦外周血中發現了胎兒的游離DNA，但由于當時受到實驗條件及檢測技術的限制，在大量母親游離DNA的背景下，要明確胎兒游離DNA的堿基序列十分困難且耗時較長，成本較高^[1]。隨著分子生物學技術的飛速發展，基因組測序技術更加敏感，可以同時量化千萬數量的游離DNA片段，準確分析及度量孕母外周血中的胎兒DNA。在孕12周后，抽取母體足量的靜脈血，利用新一代DNA測序技術對母體外周血漿中的游離DNA片段進行測序分析，可獲得胎兒基因信息，從而排查胎兒染色體疾病，胎兒游離DNA存在于孕婦外周血中是該項技術實現的現實依據^[2]。有研究報道，孕婦外周血中胎兒游離DNA含量約為全部游離DNA含量的3%-13%，甚至更高，主要來源于胎盤，胎兒出生后極短時間內即被清除^[3]。胎兒染色體的異常會對孕母外周血中DNA含量帶來影響，靈敏度極高的基因探測及分析技術可發現其中的微小變化，為該技術的實現提供理論依據。

2 無創DNA產前檢測技術的臨床應用

2.1單倍體染色體疾病的篩查

2011年無創DNA技術首次應用于臨床產前檢測，并且很快受到各國醫療行業的追捧。有研究表明無創DNA技術可排查99%的唐氏綜合征，且假陽性率低于0.1%，絲毫不遜于傳統的有創羊膜腔穿刺羊水胎兒細胞培養的準確性，且大大降低了對母體健康及胎兒安全的影響，將檢測周期由原先的2周縮短到1-2天^[4、5]。專業人士一致認為無創DNA檢測對胎兒非整倍體疾病的篩查大有益處，應積極推廣，將無創DNA檢測技術作為孕10周后產前檢測的首選方法^[6]。

2.2單基因疾病

無創DNA技術在篩查胎兒染色體非整倍體疾病外，進一步發展為對單基因疾病的篩查^[7]。目前所知，人類23個染色體上分布有約3萬余基因，每個基因約包含27000個堿基。單個基因突變導致的基因信息改變從而致病，稱為單基因病。迄今已明確的單基因病有近五千種，涉及基因三千余，其中一部分發病率高，危害性大的常見單基因病已能進行臨床基因診斷，如遺傳性耳聾、地中海貧血等^[8、9]。

在無創DNA檢測染色體非整倍體疾病日漸成熟的今天，科學家在努力實現單基因病的檢測，該項技術最大的障礙是在母體外周血中得到足量的胎兒遺傳物質。前文已述，在母體外周血中胎兒游離核酸以及有核紅細胞含量極低，必須通過特定的方法將其從母血中準確的識別、分離和鑒定出來，才能對其所含基因進行準確分析。目前，國際上多通過采集孕婦抗凝外周血后再離心兩次得到血漿成分，最后再手工過柱法商品化試劑盒提取血漿^[10、11]。目前有效的分離純化方法還十分有限，在一定程度上限制了臨床使用。

2.3父源性遺傳疾病的篩查

目前，使用游離胎兒DNA篩查單基因遺傳病的研究已經從性別篩查逐漸過渡到直接檢測胎兒所攜主要致病基因是否以父源性為主。這類疾病不受母親遺傳物質的影響，遵從父系常染色體顯性遺傳規律，一旦在母親外周血中發現這類基因，即可證實來自于胎兒，而非母體本身^[12]。分析父系遺傳的等位基因還可以獲得其他臨床相關信息，包括分析Y染色體基因序列的出現或缺失得知患兒性別（特異性與靈敏性可達到100%），鑒別胎兒性別還有利于常染色體隱性疾病的篩查，例如先天性腎上腺增生等，減少了對男性胎兒進行不必要的地塞米松治療^[13、14]。對于常染色體顯性遺傳病，可以直接診斷胎兒是否攜帶突變基因，即是否有患病的風險。而對于常染色體隱性遺傳病，主要是檢測胎兒是否遺傳了父源性的致病基因，這樣可使部分孕婦免受有創性產前診斷的痛苦。目前應用無創DNA作為首選篩查手段的此類疾病包括β-地中海貧血、纖維樣囊性變、先天性腎上腺皮質增生^[15-18]。獲取血漿成分之后，學者多通過檢測孕婦血漿中的男性胎兒特異性基因序列（SRY， DYS14， ZFXY等）來確定提取的血漿中是否含有胎兒成分。但是這一技術的缺陷在于選擇基因作為母血漿中胎兒游離的檢測標記存在性別依賴性，因為陰性結果既可能是由妊娠女胎造成也有可能是由提取失敗造成，因而無法對檢測出的陰性結果進行明確的判斷;診斷結果缺乏父系基因的陽性對照，若進一步檢查父親的基因，則可證實母親血漿中的這類基因來源于胎兒。

2.4母源性遺傳疾病的篩查

這類基因在胎兒與母體之間具有一致性，在強大的母親基因背景下，評估母體血漿中胎兒這類突變基因的情況更為困難，研究者對這類基因的檢測建立了更為復雜的策略。隨著科技的進步，這類策略得以實現，例如大規模平行測序技術，數據化聚合酶鏈反應技術等使外周血中DNA的含量的測量更為敏感且精確，使遺傳自母親的等位基因變異疾病的篩查成為現實。

目前最為常用且有效的基因篩查技術為相對突變劑量（relative mutation dosage，RMD）分析以及相對單倍型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）分析^[19]。RMD可以確定母體血漿中突變的相對量和致病基因的野生型等位基因。這種方法需要針對每個突變設計特異性檢測，然后推測出胎兒是否受影響^[20]。該方法較PCR技術更為便宜，但需要胎兒DNA比例相對較大，對部分突變檢測效果有限。例如，在先天性腎上腺皮質增生癥中發生突變的21-羥化酶基因具有高度同源的假基因，因此很難針對高度片段化的母體血漿DNA進行檢測。此外，定制檢測有時需時較長，應用受限。RHDO不依賴于特異性突變的檢測，可對整個胎兒基因組進行基因分型，并與父母雙方的單倍體型進行比較^[21]。RHDO可同時分析多個基因位點的突變條件，不要求反應條件最優化（PCR化驗對此要求非常嚴格），更為敏感。

3 無創DNA產前檢測技術的局限性

胎兒DNA碎片是無創DNA檢測結果分析的最重要的穩定性參數，因此母親外周血漿中胎兒游離DNA碎片含量過低是無創DNA結果無意義的最重要原因^[22]。胎兒游離DNA含量受胎兒染色體狀態、母親子癇前期及是否吸煙等有關，受孕早期篩查參數的影響^[23]。母親體重是影響胎兒DNA碎片的最重要因素，有研究表明肥胖的孕婦無創DNA檢查失敗及假陰性率明顯上升，其他的生物學因素，包括植入胎盤、多胎流產、母親基因型異常、母親患惡性腫瘤等也對無創DNA結果的準確性產生不利影響^[24、25]。

盡管無創DNA檢測的巨大優勢是毋庸置疑的，但是應用此項技術的核心問題在于明確它潛在的局限性。由于胎盤嵌合體的存在，導致胎盤的游離核酸與胎兒本身的核型并非總是一致，導致可能出現假陽性和假陰性結果，因此，針對胎兒游離核酸的檢測技術只能作為篩查手段不能代替診斷。對每位都要接受產前檢查的孕婦，必須告知她們無創DNA檢測不能取代傳統常規產前檢測。每一個無創DNA的陽性結果在作出最終結論前均應被傳統有創產前檢查結果論證，同樣的，其陰性結果也不影響自然妊娠的其他產前檢測。

4 展望

較傳統的產前檢查項目無創DNA技術可減低產前檢查的成本，將無創DNA作為所有懷孕婦女的篩查胎兒染色體非整倍體疾病的首選檢查是目前較為可行的方法之一，或者在傳統產前檢查結果的基礎上將無創DNA作為進一步篩查胎兒非整倍體疾病的手段。除了篩查13三倍體，18三倍體，21三倍體這類常見的胎兒染色體異常外，同樣適用于篩查性染色體異常等疾病，還能篩查多胎妊娠的胎兒染色體異常，可以探測基因突變（具體適應癥仍在探索中）。且隨著各種分子技術的發展，單基因疾病的無創DNA技術日益成熟，RMD、RDHO分析技術是檢測母親遺傳突變或父母親共同遺傳突變的強有力的工具。此外，隨著測序費用的減少，靶基因序列檢測聯合RDHO分析技術將成為單基因疾病無創DNA檢測的首選。并且學者研究發現，在孕早期的母血中存在微量的胎兒有核紅細胞，因其單核、含有完整胎兒遺傳信息且細胞周期短，被認為是實施無創DNA產前檢測較理想的靶點。

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