一種快速檢測單增李斯特菌的雙重PCR方法

王昊宇

【摘 要】探討檢測新鮮海螺樣品中單增李斯特菌的雙重PCR快速檢測方法。基于單增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌屬的16sRNA基因分別合成兩對引物，對影響PCR的主要因素進行優化，最終確定同時檢測單增李斯特菌兩個特異性基因的雙重PCR最佳反應體系及條件，該方法對于純培養物的最低檢出限為102CFU/mL，模擬污染海螺樣品的檢測限為8CFU/g。

【關鍵詞】單增李斯特菌；雙重PCR；海螺樣品

【中圖分類號】R197 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2019）01-0225-02

本工作將單增李斯特菌最重要的毒力因子-編碼溶血素的hlyA基因，與李斯特菌屬16sRNA基因同時作為單增李斯特菌的檢測指標，將雙重PCR方法與選擇性增菌法相結合，旨在建立一種快速靈敏檢測單增李斯特菌的雙重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

單增李斯特菌標準株由省疾病預防控制中心提供；大腸桿菌（Escherichia coil）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、產氣桿菌（Aerobacter aerogenes）和傷寒桿菌（Salmonella typhi）為本實驗室保存菌株。

1.1.2 試劑

李斯特氏菌顯色培養基、單增李斯特菌成套生化鑒定管、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、李氏增菌肉湯LB1、萘啶酮酸、吖啶黃素 青島高科園海博生物有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA以及PCR相關試劑 北京天根生化有限公司。

1.1.3 引物序列

根據文獻[1]以單增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌屬的16sRNA基因作為靶基因分別合成兩對特異性引物，所用引物序列見表一，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 儀器

VersaDoc凝膠成像儀 美國伯樂；PCR擴增儀 美國伯樂；JM-250電泳儀 大連捷邁科貿有限公司；D-37520高速冷凍離心機 德國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的活化培養

取-80℃、25%甘油凍存的菌種，復蘇培養后，分別劃線于細菌培養基上，37℃培養24h，連續活化兩次，將單菌落接種于普通肉湯培養基中，37℃振蕩培養18h。

1.2.2 細菌基因組DNA的制備

取1ml菌液按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進行DNA提取，并溶于100 μL TE緩沖液中，于-20℃下保存。

1.2.3 雙重PCR的體系建立及優化

雙重PCR擴增體系：10×Buffer（Mg2+）5?L 、dNTPs（2.5mmol/L）4?L、兩對10mmol/L的上下游引物各1?L、 DNA模板5?L，Taq酶（2.5U/?L）0.8?L ，用ddH2O補足至50?L。

雙重PCR反應條件：采用熱啟動。95℃預變性3min ，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，共30個循環，72℃終延伸10min。

在上述反應體系和條件下，對退火溫度進行優化，分別設定退火溫度為：55℃、55.8℃、57.1℃、58.9℃、61.4℃、63.3℃，通過對電泳結果的分析，最終確定最佳退火溫度。

1.2.4 雙重PCR特異性及靈敏度檢測

特異性檢測：分別提取單增李斯特標準株、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、產氣桿菌及傷寒桿菌模板DNA，在最佳雙重PCR體系及條件下擴增，檢測引物特異性。

靈敏度檢測：將過夜培養的單增李斯特菌菌液用無菌的生理鹽水10倍梯度稀釋，使目標菌濃度依次為：106CFU/mL 、105CFU/mL 、104CFU/mL 、103CFU/mL 、102CFU/mL 、10CFU/mL。分別提取不同濃度菌液的模板DNA，在最佳雙重PCR體系及條件下擴增，確定雙重PCR的檢測靈敏度。

1.2.5 人工污染海螺樣品的制備及檢出限檢測

無菌操作取一只海螺的軟組織及體液（陰性）共12.5g，加入李氏增菌肉湯LB1（含抑菌劑）中，充分搖勻制成均質液，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋初始濃度為106CFU/mL的單增李斯特菌菌液，取1mL不同稀釋度的菌液分別加入待檢試樣的均質液中，30℃震蕩培養24h，分別取1mL增菌液按照方法1.2.2提取模板DNA，進行雙重PCR檢測，確定人工污染海螺樣品的最低檢出限。

2 結果與分析

2.1 不同退火溫度下雙重PCR擴增結果

對雙重PCR的退火溫度進行優化（圖一），結果可見兩條帶在一定溫度范圍內均能有效擴增， 702bp 條帶在相同退火溫度下的擴增效果均較938bp條帶明顯，其中在退火溫度為55.8℃和58.9℃時，兩特異條帶同時擴增清晰，考慮到降低退火溫度可以提高擴增效率，最終選定55.8℃為最佳退火溫度，從而確定雙重PCR最佳反應條件。

2.2 特異性及靈敏度檢測結果

在雙重PCR最佳反應體系及條件下，應用引物1及引物2對不同細菌的模板DNA進行雙重PCR擴增。特異性檢測結果（圖二）顯示：只有單增李斯特菌標準株可擴增出938bp和702bp二條帶，而其他6株致病菌除引物二聚體外均未出現任何擴增條帶，該雙重PCR特異性良好。

將初始濃度分別為106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的單增李斯特菌菌液的DNA作為雙重PCR反應模板，確定雙重PCR檢測純菌液的靈敏度，由圖三可知：兩特異條帶同時檢出的最低菌液濃度為102CFU/mL，其靈敏度能夠滿足樣品選擇性增菌后的檢測要求。

2.3人工污染海螺樣品的檢出限

單增李斯特菌菌液初始濃度為106CFU/mL，取不同稀釋濃度菌液1mL，污染12.5g海螺陰性樣品，30℃ LB1震蕩培養24h，分別提取增菌液DNA進行雙重PCR檢測，檢測結果如圖四所示，當濃度為102CFU/mL的菌液污染海螺樣模板品仍可檢出，經計算，此雙重PCR檢測模擬污染海螺樣品檢出限為8CFU/g。

3 結論

本工作所采用的檢測水產品中單增李斯特菌的雙重PCR快速方法，菌液靈敏度為102CFU/mL，模擬污染海螺樣品檢出限為8CFU/g，全程檢測時間包括增菌時間在內僅27小時，與國標方法相比省時省力且經濟，可快速檢測出實際樣品中的陽性樣品與疑似陽性樣品，可作為海螺樣品中單增李斯特菌的初步鑒定方法。

參考文獻

[1]王海艷，劉中學，等.食品中單增李斯特菌PCR檢測方法所用引物的特異性比較[J].檢驗檢疫科學，2007（6）：3-8.（J）