ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變的對比分析

李愛鋒

摘 要：目的：分析ARMS法（amplification refractory mutation system）和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變的效果。方法：選擇濃度相同的人類EBFR基因18、19、20、21號外顯子野生型質粒、突變型質粒按照一定比例混合制備成20種標準模板，將其均分為對照組和觀察組，各20例，采用ARMS法檢測小樣本中的EGFR基因突變情況，采用Sanger測序法對EGFR基因18、19、20、21號外顯子野生型及突變型標準質粒多種混合比例樣本進行檢測，比較兩種檢測方法的一致性。結果：對照組與觀察組基因突變率均為100%，兩種檢測方法的一致率為100%。結論：臨床上采用ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變，兩種檢測方法的檢測結果具有較高的一致性。

關鍵詞：ARMS法;Sanger測序法;晚期肺腺癌;小標本EGFR;基因突變

前言

肺癌的發病率在逐年上升，但是有研究人員發現，臨床上有75% 左右的肺癌患者在被確診時就已是局部晚期，部分患者已經出現了遠處轉移，比較常見的一種亞型就是腺癌。在接受全身化療的晚期肺癌中，有大部分患者只需要通過小活檢標本或者細胞學樣本就能被明確診斷[1]。EGFR基因檢測是臨床上診斷肺癌分子的重要手段，目前應用比較廣泛的有ARMS法和Sanger測序法，從理論上發現，ARMS法較Sanger測序法的特異度和靈敏度均比較高，但是其在小樣本檢測中存在差異的報道比較少。而目前，對于臨床晚期肺癌患者來說，其病理標本大多為小組織樣本，因此，對兩種方法檢測晚期肺癌小樣本EGFR基因突變的價值進行比較是非常有必要的。本次就對兩種方法檢測晚期肺腺癌患者小樣本EGFR基因突變的效果進行詳細的分析。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇濃度相同的人類EBFR基因18、19、20、21號外顯子野生型質粒、突變型質粒按照一定比例混合制備成20種標準模板，分為對照組和觀察組，具體如下：

1.2方法

1.2.1采用ARMS法檢測對照組小樣本中的EGFR基因突變情況。使用人類EGFR基因突變檢測試劑盒（蝎形探針ARMS熒光PCR法）therascreen? ? ? EGFR RGQ PCR Kit以及Lightcycler 480進行基因檢測。

結果分析實驗步驟：

（1）參照ABI7500操作手冊進行軟件操作。

依據檢測結果判斷，報告檢測標本有無基因突變。

a.在PCR管冰架上架上滅菌后的八聯管，將反應混合物依次加入八聯管中，然后小心的蓋上八聯管管蓋;

b.將加樣后封閉好的八聯管振蕩混勻，然后離心使液體聚于管底;

c.按下PCR儀上的出艙鍵，將八聯管放于艙中，然后點擊進艙送入熒光定量PCR儀中;

d.儀器顯示正常，然后編輯反應程序，選擇Taqman反應程序：

（2）在FAM通道，運行外控（Control）Ct值（Cycle threshold，循環閾值）的計算，Ct值≤34.0，可以繼續分析。

（3）運行無模板對照（NTC）時，FAM信號無曲線升起，說明實驗無污染存在，可以繼續分析實驗情況。當Ct值≥35.0時，有微弱的擴增信號，對實驗的影響極微，可以繼續分析實驗情況。

（4）運行陽性質控品，所有陽性質控Ct值一般小于30.0。

（5）在FAM通道中運行Ct的計算，結果如下：

檢測樣品均曲線呈S型且C≤34.0;陰性對照（NTC）無擴增曲線或Ct值≥35.0;陽性對照出現擴增曲線且Ct值≤30.0。

依據檢測結果判斷，報告檢測樣品均有基因突變。

1.2.2采用Sanger測序法檢測觀察組小樣本中的EGFR基因突變情況。使用4組引物對EGFR外顯子18-21進行PCR擴增，使用循環測序試劑盒及ABI3730進行正向和反向測序。

對表1 中20種模板采用與EGFR癌基因樣本同樣的引物、反應體系及循環條件進行擴增測序，樣本采用的是2輪PCR擴增，2輪的擴增引物相同，具體見表2-表4。

表3? 第一輪的PCR程序如下：

表4? 第二輪的PCR程序如下：

PCR產物電泳產生明顯條帶，才對產物割膠純化后測序，驗證Sanger測序法對突變檢測的靈敏度，對突變型與野生型混合質粒系列用Sanger法測序，驗證其對突變的檢測極限，引物是F端和R端引物。進行重復的平行測序。

Sanger測序法對人類EBFR基因18、19、20、21號外顯子野生型質粒、突變型質粒按照不同比例混合樣本檢測結果顯示，擴增產物經割膠純化后進行測序反應，均可檢測出10%比例突變，具體如下：

- EGFR 18號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合;

- EGFR 19號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合;

- EGFR 20號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合;

- EGFR 21號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合。

1.3觀察指標

比較兩種檢測方法的一致性。

1.4統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，以P<0.05，表示差異有統計學意義為標準，將其中的計量資料用均數標準差表示，用t檢驗，將其中的計數資料用%表示，用χ2檢驗。

2結果

2.1對照組EGFR基因檢測結果

對照組EGFR基因突變率為100%（20/20），野生型0%（0/20），其中外顯子18突變5例，外顯子19突變5例，外顯子20突變5例，外顯子21突變5例。

2.2觀察組EGFR基因檢測結果。

觀察組EGFR基因突變率為100%（20/20），野生型0%（0/20），其中外顯子18突變5例，外顯子19突變5例，外顯子20突變5例，外顯子21突變5例。

2.3ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變的一致性

對20列小標本EGFR基因突變情況均采用了ARMS法和Sanger測序法檢測，兩種檢測方法的一致率為100%（20/20），Kappa系數為1，P<0.05。

3討論

NCCN指南中推薦的根據是否存在EGFR基因突變實踐對晚期肺腺癌患者的治療進行了指導，并且不同的EGFR基因突變類型，其采用靶向治療后的效果也存在著明顯的差異，因此，對肺腺癌患者的EGFR基因突變情況進行準確的檢測，能夠為臨床治療提供有效的指導依據[2]。但是臨床上EGFR基因突變的檢測結果與臨床因素、檢測方法、小樣本因素等有關[3]。

ARMS法和Sanger測序法是臨床上常用的小標本EGFR基因突變檢測方法，前者能夠檢測出組織中0.1%～1%的突變體，而后者對EGFR基因突變細胞的檢出率為10%～20%[4]。當樣本中的DNA難以達到分光光度法所能夠檢測到最低限度時，小劑量與低比例的腫瘤DNA則會被誤診為EGFR野生型。樣本的選擇對檢測結果也有著重要的影響，臨床上所使用的標本大都是經過福爾馬林固定且被包埋于石蠟中，這對標本中核酸的完整性造成了破壞。近年來，隨著技術手段的進步，用于EGFR基因突變情況檢測的樣本也逐漸多樣化，如手術切除、活檢、胸水、外周血等[5]。

本次研究中分別使用了ARMS法和Sanger測序法對20列小標本EGFR基因突變檢測，結果發現，對照組與觀察組突變率均為100%（20/20），兩種檢測方法的一致率為100%（20/20）。提示，對于腫瘤細胞比較少的樣本，就需要使用敏感性比較高的方法進行檢測[6、7]。

綜上所述，臨床上采用ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變情況，兩種檢測方法具有較高的一致性。但是，對肺腺癌小標本組織行ARMS法和Sanger測序法檢測小標本EGFR基因突變還存在在這一定的差異性，尤其是采用Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變情況時應謹慎決定，因為其最低檢測限在10%左右。

參考文獻：

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[2]葛闖，易琳，唐萬燕，等.Sanger測序與ARMS-PCR在非小細胞肺癌EGFR基因突變檢測中的比較及應用評價[J].國際檢驗醫學雜志，2018，39（21）：2648-2653.

[3]梁繼珍，蘇寧，謝亞琳，等.ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變分析[J].實用醫學雜志，2018，34（13）：2104-2107+2118.

[4]唐翠蘭，鄭曉克，周建文，等.ARMS法與下一代測序法檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變的比較[J].解剖學研究，2018，40（01）：49-53.

[5]肖越.ARMS法在檢測晚期肺腺癌不同小標本中EGFR基因突變的比較[D].南昌大學，2014，22（16）：256-268.

[6]蘇寧.ARMS法和測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變的分析[A].中國抗癌協會，2013，34（07）：1247-1251.

[7]梁繼珍，蘇寧，謝亞琳，et al.ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標本EGFR基因突變分析[J].實用醫學雜志，2018（1）：2104-2107，2118.