不同參數精子頂體酶活性與精子在IVF治療中受精能力的關系研究

馮 星 葉 紅 胡元波 湯佳楠 王志凱 孫予華 顧一驊 鄭菊芬,,**

1.上海市計生所醫院檢驗科（上海 200032）

2.上海市計劃生育科學研究所，國家人口和計劃生育避孕藥具重點實驗室（上海 200032）

3.海軍軍醫大學第一附屬醫院生殖中心（上海 200433）

前 言

男性不育癥發病率高，然而病因大多都不明確[1]，單精子卵胞漿內注射技術 （intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的發明給男性不育癥的治療帶來重大突破，但由于受精過程是將精子直接注射入卵子，因而無法觀察到精子的自然受精結果，也就不能解決病因和診斷等問題。ICSI技術是無精子癥和嚴重少弱精子癥等嚴重男性不育癥的首選治療方法，但更多其他不育癥希望能自然生育，其前提則是精子必須具備自然受精能力，所以，尋找有效的精子功能試驗來輔助判斷不同類型精子的受精能力是生殖男科重要的研究方向。常規體外受精技術（in vitro fertilization，IVF）雖然是用來治療輸卵管阻塞等女性不孕癥問題，但由于能在體外直接觀察到精子的受精結果，因而可以用來驗證精子功能試驗對受精能力的預測作用；特別時近年來使用的短時IVF[2]治療既能觀察到精子的受精結果，又能避免因完全不受精或低受精等對患者夫婦帶來不良結果的倫理問題，為各項精子功能試驗提供了操作性強又準確的臨床驗證方法。

頂體酶是位于精子頭部的頂體內，是精子頭部穿過卵子透明帶完成受精過程中不可缺少的水解酶，也是自然受精的必需步驟。不少研究[3，4]發現精子頂體酶活性與精子參數和受精能力存在顯著相關性，但精子參數受患者自身狀態、檢測設備型號和檢測人員經驗等諸多因素影響波動幅度較大[5-7]，而且診斷性檢測手段通常與IVF治療日會有幾個月甚至更長的時間差。為了將患者和技術等影響因素降到最低水平，本研究將懷孕率排除在外，這樣就可以減少對入組病例數量的要求以確保對每個IVF病例進行全程狀態追蹤隨訪，并只對近期完成IVF治療的病例做頂體酶活性值測定，并利用體外受精結果來驗證頂體酶活性值測定對不同參數精子受精能力判斷的準確性，旨在為不同精子樣本尋找更合適的精子功能試驗作為受精能力判斷的輔助診斷工具，以便讓患者選擇更合適的治療方式，減少人力和財力的浪費。

材料與方法

一、研究對象和納入標準

（一）研究對象

2016年12月～2018年9月期間在上海計生所醫院門診做精子頂體酶活性測定并在長海醫院接受IVF或短時IVF治療的不育癥病例，共75例。

（二）納入標準

1.醫療依從性良好并準備在近期接受IVF治療的不育癥病例：每次取精前全身狀態良好，禁欲時間3～5d，取精時標本完整；在女方促排期間愿意接受并配合復查精液者；

2.精液分析結果入組標準：至少有兩次相近精液檢測結果，精液量≥1.0 mL，精子濃度≥10×106/mL，前向運動精子百分率≥10%，精子正常形態率≥3%，精液中白細胞＜1×106/mL；

3.有IVF不受精或受精不良史病例優先入組；

4.女方年齡小于40歲，成熟卵子數≥2個，病因為輸卵管因素、多囊卵巢綜合征或不明原因性不孕癥；

5.男女雙方染色體均正常。

二、研究方法

（一）男科臨床醫師全程隨訪

篩選入組病例并與之充分溝通，告知檢測意義及需要配合的注意事項；在女方配偶促排卵當月對男方進行頂體酶檢測，在IVF進周期間保持全程跟蹤隨訪，并及時處理突發事件如感冒等其他意外狀況，盡量減少影響精子質量的外在因素；當頂體酶低于正常值或頂體酶值正常但精液參數處理前后不理想時給出短時IVF治療建議。由于本文通訊作者既是男科臨床醫生同時又參與胚胎實驗室工作，有便利條件嚴格選擇入組病例并控制各項影響因素。

（二）精液分析

按照WHO第5版標準進行精液分析，禁欲2～7d之間采集精液，1h內行精液常規分析，并由具備胚胎實驗室經驗的男科臨床醫師同時做人工計數矯正；精子形態分析采用改良巴氏染色法進行，計數不少于200個精子，并由胚胎實驗室醫師復核。

（三）精子測定方法

采用Na-苯甲酰 -DL-精胺酸-P-硝酰基苯胺(BAPNA)法進行頂體酶活性測定[3]，使用天津瑞愛金生物科技有限公司的試劑盒和美譜達PV2的可見分光光度計。正常參考值為48.2～218.7 μIU/106個精子，低于48.2 μIU/106精子為低值。

頂體酶活性測定方法的質量控制：（1）精子濃度計數雙人矯正；（2）傾倒精漿時要留意是否有精子的薄膜留在試管內；（3）精子要充分與反應液混勻,黏稠度高者需充分吹打；（4）反應溫度要在24攝氏度水浴孵育；（5）臨用前配制反應液，加完終止液離心后立即比色；（6）注意試劑批間差。

（四）IVF或短時IVF操作

采用控制性超排卵，以常規促性腺激素釋放激素（gonadotrophin-releasing hormone agonist,GnRHa）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）促排卵方案。常規IVF在取卵后3～4h將卵子加至制作好的受精滴中，加精后16～18h觀察受精情況。短時IVF在取卵后1～2h將卵子加至制作好的受精滴中，加精后4～6h觀察第二極體排出情況，當天即對第二極體排出不明顯的卵子進行ICSI注射操作，受精后16～18h觀察并記錄受精情況。為減少卵子成熟度對受精的影響，本研究受精率統計分母為成熟卵子數而非總獲卵數。

三、統計學分析

使用了SPSS 13.0軟件來分析所得到的數據，計數數據用均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢測，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

研究結果

一、一般臨床資料

本研究共納入IVF術前接受精子頂體酶活性測定病人 75 例，男方平均年齡（32.97±5.22）歲（25～51 歲），女方平均年齡（31.24±3.80）歲（23～39 歲），平均不育年限（3.80±2.31）年（0.5～11 年），其中男性繼發性不育 28例，女性繼發性不孕28例；不明原因原發性不育癥例12 例。 精液參數：精液量（2.58±1.02）mL（1.0～5.0）mL、精子濃度（48.74±31.37）× 106/mL[（12～172）× 106/mL]、前向運動精子百分率（43.13±13.10）%(13～80%)、快速前向運動精子百分率（19.67±6.93）%(5～42%)；除 4 例精子正常形態率在臨界狀態外，其余精子形態均正常。3例臨界形態精子處在頂體酶低值組，其中2例短時IVF不受精，1例IVF低受精；另外1例處在頂體酶正常值組，IVF受精率不到50%。由于有不良受精史和少弱精子癥病例優先入組，所以總受精率較低為54.0%（343/635）,新鮮移植周期臨床妊娠率 52.6%(20/38)。

二、按頂體酶值分組的結果比較

按頂體酶活性值分類，低于48.2 μIU/106個精子為低值組，高于48.2 μIU/106個精子為正常值組：低值組和正常值組不明原因性不孕不育分別7例和5例。兩組的基本情況見表1，低值組男方年齡稍高于正常組（P＜0.01），兩組的頂體酶活性值和精子濃度有顯著差異（P＜0.01），但快速前向運動精子百分率和前向運動精子百分率均無顯著差異，差異無統計學意義（P＞0.05）。頂體酶低值組的受精率顯著低于正常值組（P＜0.01），低受精病例明顯高于正常值組（P＜0.05），但完全不受精率僅比正常值組稍高 （P＞0.05）。正常值組完全不受精8例，卵子數均在6枚以上，沒有低受精病例，呈現“全”或“無”的受精模式；低值組完全不受精13例，只有4例卵子數6枚以上，另有低受精5例，見表2。

表1頂體酶正常值組和低值組的基本情況

表2頂體酶正常值組和低值組的臨床和實例數據比較

表3兩種不同精子濃度組的基本情況

三、按精子濃度分組的結果比較

兩組的基本情況見表3。按精子濃度分為低濃度組（10～35)×106/mL）和高濃度組（＞35 ×106/mL），兩組組的精子濃度和頂體酶活性值存在顯著性差異（P＜0.01），快速前向運動精子百分率和前向運動精子百分率也存在顯著性差異（P＜0.01）。精子低濃度組的受精率顯著低于高濃度組 （P＜0.01），低受精病例明顯高于高濃度組（P＜0.05），但完全不受精率比正常值組稍低，無統計學意義（P＞0.05）。低濃度組中完全不受精14例（其中5例卵子數6枚以上），低受精5例；頂體酶異常占80.56%（29/36），其中不受精和低受精率為58.62%(17/29)。高濃度組完全不受精7例（卵子數均在6枚以上），沒有低受精病例，呈現“全”或“無”的受精模式；頂體酶異常占12.8%（5/39），其中只有1例不受精，見表4。

表4兩種不同精子濃度組的臨床和實驗數據比較

表5精子低濃度組中不同頂體酶組的基本情況

四、精子低濃度組再按頂體酶值分組結果比較

兩組的基本情況見表5。精子低濃度組和頂體酶低值組的不受精率和低受精比例明顯升高，特別是低受精情況更為顯著，在精子低濃度組再按頂體酶正常值組和低值組分組發現：兩組的精子濃度、前向運動精子百分率和快速前向運動精子百分率均無統計學差異（P＞0.05），但頂體酶活性值和受精率存在顯著性差異（P＜0.01）：正常值組完全不受精2例，沒有低受精病例；低值組完全不受精12例，低受精5例，其差異均無顯著性（P＞0.05，見表 6）。

表6精子低濃度組中不同頂體酶組的臨床和實驗數據比較

討 論

輔助生殖技術早期研究[8，9]就證實精子參數與受精結果相關性較強，而臨床妊娠結局不受精子參數影響，卻與女性配偶的年齡和生育狀態相關性更強，所以本研究排除懷孕率統計可以大大減少入組病例數，這樣更能集中精力做好IVF期間的隨訪追蹤和各項質控工作，將研究重點關注在精子參數、頂體酶與受精能力的相關性上。頂體酶活性對IVF受精結果的影響一直存在著爭議，國內大多研究[10，11]認為頂體酶活性與精子體外受精能力密切相關,頂體酶活性低下可能是導致受精失敗的原因。但國外雖然在早期對頂體酶研究較多，近年來卻有減少趨勢，可能因大多研究[12，13]認為頂體酶活性與IVF受精結局無相關性，最近也有研究[14]認為精子頂體功能與受精能力有一定的相關性，但敏感性和特異性均不高。根據我們的經驗推測這些不同結果可能與入組的精液參數標準和精液的質量控制體系密切相關，精子參數中形態學高畸形率影響頂體酶活性并導致受精能力下降的研究[15，16]結果較為一致，現行的嚴格標準形態學[17]可以作為獨立的受精能力預測指標，但最大的缺陷在于不同實驗室和不同檢驗人員的操作誤差相當大，無法給出準確可靠的診斷依據；我們前期研究顯示相似結果，所以本課題入組的大多為正常形態精子，只有4例精子形態學處于臨界狀態（3%），IVF受精結果都不理想：2例不受精，1例低受精，另1例受精率低于50%。同樣道理，我們選擇精子濃度≥10×106/mL，前向運動精子百分率≥10%的病例入組，因為比這些參數更差的精子選擇IVF治療后，其不受精或低受精病例的增多會顯著提高陽性結果，但對較好精子卻不一定有臨床意義；而嚴重少弱畸形精子癥精子由于自然受精能力極差，僅靠精液常規檢測和形態學即可決定是否需要接受ICSI技術治療，無需額外方法來輔佐。本課題對75例入組病例按頂體酶活性值分類，發現頂體酶低值組和正常值組的頂體酶活性值和精子濃度有顯著差異，但快速前向運動精子百分率和前向運動精子百分率均無顯著差異，該結果與少數研究[18]相一致；而大多研究[11，19]則認為除了精子濃度和形態外，與前向運動精子百分率也有顯著差異，這可能與本課題排除嚴重少弱精子癥入組有關。我們對精子濃度進行統計處理發現35×106/mL可作為分界線，再細分為低濃度組[（10～35）×106/mL和高濃度組（＞35×106/mL），兩組的精子濃度和頂體酶活性值存在顯著性差異，快速前向運動精子百分率和前向運動精子百分率也存在顯著性差異。精子低濃度組的受精率顯著低于高濃度組，主要是低受精病例明顯多于高濃度組，但完全不受精病例僅比正常值組稍多無統計學意義，頂體酶異常占80.6%（29/36），其中不受精和低受精率為58.62%(17/29)；高濃度組精子頂體酶活性大多正常，出現“全”或“無”的受精模式，做頂體酶活性檢測無法預防完全不受精的發生，該現象提示高濃度組與低濃度組精子不受精的原因可能存在差異，需要用另外受精途徑研究解釋。將精子低濃度組再按頂體酶值分組，頂體酶低值組的受精率顯著低于頂體酶正常值組，而兩組的精子濃度、活動力和不受精率均無顯著性差異，這種情況提示了低濃度組的不受精或低受精可能與精子頂體酶活性下降直接相關；因而，對低濃度組精子有必要進一步做頂體酶活性檢測，頂體酶低值者建議短時IVF治療，能有效減少甚至避免不受精和低受精病例的出現。

與大多數精子功能試驗一樣，頂體酶活性值測定存在著因不同實驗室的檢測方法和質量控制體系不統一而導致結果可比性差的情況。為了加強質控系統管理，本研究在頂體酶測定時間的選擇、患者精液檢測注意事項宣教、精子濃度準確計數和頂體酶活性其他影響因素如精液中的白細胞水平[20]等各個環節都做了嚴格限定，但仍然不可避免存在患者依從性不一、精液檢測技術水平差異和頂體酶試劑批間差等問題。

本研究通過嚴格精液質控和入組參數選擇后發現，精子濃度比活動力與頂體酶活性更具相關性；在低濃度組通常伴有頂體酶活性的下降，提示低受精或不受精可能性的增大，選擇短時IVF治療能有效降低受精失敗風險；而高濃度精子頂體酶大多正常，同時呈現“全”或“無”的受精模式，其不受精原因可能與頂體酶活性無關，這類病例無需常規做頂體酶活性測定。