氣相色譜法測定雪糕中甜蜜素的不確定度評定

李宏珍，趙 婷，趙 雪，李旭軍

（成都市華測檢測技術(shù)有限公司，四川成都 610041）

0 引言

不確定度反映了在檢測過程中由誤差導(dǎo)致的實際值出現(xiàn)偏差的大小程度，是檢測結(jié)果準(zhǔn)確程度的一種評價指標(biāo)和方式。檢測機構(gòu)在出具試驗報告的同時出具該檢測項目的不確定度說明，能夠更加確切地說明該實驗室所具有的檢測能力及技術(shù)水平[1]，因此評定一個檢測項目的不確定度在試驗方法、流程及試驗結(jié)果中扮演著至關(guān)重要的角色，在實際檢測中不容忽視。

甜蜜素作為一種甜味劑食品添加劑，在食品行業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，被應(yīng)用于很多食品中，但同時也是很多食品中禁止使用的食品添加劑。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》第一法氣相色譜法，測定雪糕中的甜蜜素并進行不確定度評定。了解其不確定度的主要來源，以便在工作中引起重視并予以改進，為檢測結(jié)果的正確評價提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

7890B型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；LE204E 220 g/0.1 mg型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；SK8200HP型超聲波清洗機，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A型渦旋混合器，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品；LD5-2B型離心機，北京京立離心機有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司提供；正己烷（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰咎峁宦然c（分析純）、濃硫酸（分析純）、硫酸鋅（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 檢測方法

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》第一法氣相色譜法[2]檢測方法，稱雪糕樣品5 g于50 mL離心管，加水30 mL，超聲提取30 min，加入2 mL亞鐵氰化鉀和2 mL硫酸鋅溶液，混勻沉淀蛋白后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，過濾，收集濾液并用水定容至50 mL，混勻備用。取收集液于50 mL離心管中，冰浴冷卻5 min后加入正己烷，混勻后加入2.5 mL亞硝酸鈉溶液和2.5 mL硫酸水溶液，混勻后冰浴環(huán)境下衍生30 min，衍生期間振蕩3～5次以確保衍生完全。衍生后加入適量氯化鈉，混勻后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，取上清液上機分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液 （10.0 mg/mL） 50，100，200，500μL和甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/mL） 100，200μL，用超純水定容至10.0 mL，得到10，20，50，100，200，500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并同樣品一起衍生。

1.4 儀器條件

色譜柱HP-5（30 m×320μm×0.25μm）；進樣口溫度230℃，分流比5∶1，升溫程序為初始溫度55℃保持0 min，以10℃/min速率升至90℃保持0.5 min，以20℃/min速率升至200℃保持3 min，進樣量1μL，檢測器溫度260℃，色譜柱流量1 mL/min，氫氣流量30 mL/min，空氣流量330 mL/min。

2 數(shù)學(xué)模型建立

2.1 數(shù)學(xué)模型

評定某個項目的不確定度，應(yīng)在計算公式的基礎(chǔ)上建立數(shù)學(xué)模型并逐步分析可能引入不確定度的因素[3]，試驗中甜蜜素含量計算公式為：

式中：X1——試樣中甜蜜素的含量，g/kg；

C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出定容樣液中甜蜜素的質(zhì)量濃度，μg/mL；

m——試樣質(zhì)量，g；

V——試樣的最后定容體積，mL；

f——回收率，%。

結(jié)合以上公式和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[4]，氣相色譜法測雪糕中甜蜜素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

2.2 不確定度來源的分析

結(jié)合測定試樣中甜蜜素的計算公式、檢測方法和實際操作對其不確定度來源分析可知，采用氣相色譜法測雪糕中甜蜜素含量，影響試驗結(jié)果的不確定度因素主要包括稱取樣品誤差，試樣定容誤差，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的誤差，試驗過程中回收率引入誤差[5]。

甜蜜素含量測定不確定來源見圖1。

3 各不確定度分量的分析及計算

3.1 樣品稱量引入的不確定度

當(dāng)稱樣量為5.000 0 g，所需天平的最大允許誤差為±0.1 mg，按照矩形分布原則，在樣品稱量過程中天平引入的不確定度為：

3.2 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

甜蜜素在檢測過程中由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度主要包括標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)品的稱量及標(biāo)品的配制過程，具體分析如下：

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度（P） 引入的不確定度

由甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液證書可知其純度為99.90%，按照矩形分布原則，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

相對不確定度為：

3.2.2 天平稱量引入的不確定度

標(biāo)品的稱量需用十萬分之一的天平，其最大允許誤差為±0.01 mg，按照矩形分布原則，稱取113 mg甜蜜素標(biāo)品時，由天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

相對不確定度為：

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制過程中引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品在配制過程中，所使用的定容容器和環(huán)境溫度的變化是引入不確定度的主要來源，具體分析如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品配制過程中由定容容器引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品在配制過程中需使用A級容量瓶（10.0 mL） 和A級單標(biāo)線吸量管（5.0 mL），依據(jù)JJG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程，A級容量瓶（10.0 mL）的最大允許偏差為±0.020 mL，A級單標(biāo)線吸量管（5.0 mL）最大允許偏差為±0.015 mL，按照矩形分布原則，A級容量瓶（10.0 mL） 引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

相對不確定度為：

A級單標(biāo)線吸量管（5.0 mL）引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

相對不確定度為：

則在標(biāo)準(zhǔn)品配制過程中由定容容器引入的合成不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品配制過程中環(huán)境溫度變化引入的不確定度。在標(biāo)品配制過程中，環(huán)境溫度的變化也會影響標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的準(zhǔn)確性，從而產(chǎn)生不確定度。依照J(rèn)JG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程，玻璃量器最佳使用環(huán)境溫度為20℃，而實驗室環(huán)境溫度保持在20±5℃，在20±5℃溫度范圍下，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，此系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃器具的體積膨脹系數(shù)，因此在實際檢測過程中，環(huán)境溫度變化對玻璃器具體積的影響可忽略[6]，按照矩形分布原則，標(biāo)品配制過程中溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

相對不確定度分別為：

則在標(biāo)準(zhǔn)品配制過程中由定容容器引入的不確定度為：

綜合以上分析，標(biāo)準(zhǔn)品在配制過程中引入的合成不確定度為：

3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的不確定度

用10.0 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列曲線10，20，50，100，200，500μg/mL時，需使用移液管 （1 mL） 6次和容量瓶 （10 mL） 6個[7]。

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由移液管引入的不確定度

依照J(rèn)JG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程A級1 mL移液管的允許誤差為±0.007 mL，按照矩形分布的原則，使用6次移液管（1 mL） 引入的相對不確定度為：

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由容量瓶引入的不確定度

依據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》，A級容量瓶（10.0 mL） 的最大允許偏差為±0.020 mL，照矩形分布的原則，標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由容量瓶（10 mL） 引入的相對不確定度為：

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制由環(huán)境溫度變化引入的不確定度

根據(jù)3.2標(biāo)準(zhǔn)品配制過程環(huán)境溫度變化引入的不確定度計算原則，A級移液管（1 mL） 和容量瓶（10 mL）在使

用時由環(huán)境溫度引入的相對不確定度分別為：

綜合以上分析，標(biāo)準(zhǔn)工作液在配制過程中引入的合成不確定度為：

3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

所用標(biāo)準(zhǔn)工作液為6個不同質(zhì)量濃度梯度，且每個梯度重復(fù)測定3次，并采用最小二乘法擬合甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]，得每個梯度質(zhì)量濃度的峰面積。

最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表1。

擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：

式中：y——色譜峰面積，mAU；

表1 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

a——曲線斜率；

x——甜蜜素質(zhì)量濃度，μg·mL-1；

b——截距

即擬合曲線結(jié)果為：y=2.119 3x+0.892 5，R2=1.000 0.

則標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差

對樣品重復(fù)平行測定9次，得雪糕試樣中甜蜜素的平均含量為C樣=26.615μg/mL，則由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對不確定度為：=0.008 86.

綜合以上分析，由標(biāo)準(zhǔn)品配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的合成不確定度為：

3.5 試樣定容引入的不確定度

3.5.1 定容容器引入的不確定度

試樣在處理過程中使用了A級50 mL容量瓶（50 mL），依據(jù)JJG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程，A級容量瓶（50 mL） 的最大允許偏差為±0.05 mL，按照矩形分布原則，試樣處理過程中定容容器引入的相對不確定度為：

3.5.2 定容過程中由環(huán)境溫度變化引入的不確定度

依照J(rèn)JG 196—2006常用玻璃量具檢定規(guī)程，玻璃量器應(yīng)在環(huán)境溫度為20℃條件下使用，而實驗室環(huán)境溫度保持在20±5℃，在此溫度范圍內(nèi)，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，按照矩形分布原則，在定容時溫度變化引入的相對不確定度分別為：

因此試樣定容過程中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.6 回收率引入的不確定度

樣品在進行前處理時，每一步的操作都可能引入誤差，逐步分析每一操作所引入的不確定度很困難，則結(jié)合實際工作情況，可用回收率來統(tǒng)一評定試樣在處理過程中引入的不確定度[9]。對雪糕樣品進行高、中、低3個水平的加標(biāo)回收試驗，且每個水平進行3次平行測定，根據(jù)9次測定結(jié)果計算其回收率。

加標(biāo)回收試驗引入的不確定度見表2。

表2 加標(biāo)回收試驗引入的不確定度

則由樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[10]為：

4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

綜合以上各個分量的相對不確定度，計算氣相色譜法測定雪糕中甜蜜素的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5 擴展不確定度

參照標(biāo)準(zhǔn)JJF 1059.1—2012測量不確定度評定與表示[11]，對于大多數(shù)測定不確定評估，取置信水平95%，k=2。試驗用氣相色譜法測定雪糕中甜蜜素含量的平均結(jié)果X=0.266 g/kg，則擴展不確定度為：

因此，按照國家檢測標(biāo)準(zhǔn)用氣相色譜法對雪糕中甜蜜素進行測定，其測定結(jié)果為X=0.266 g/kg±0.015 0 g/kg，k=2，p=95%。

6 結(jié)論

采用氣相色譜法測定雪糕中甜蜜素含量結(jié)果：0.266 g/kg±0.015 0 g/kg，k=2，p=95%。參考國標(biāo)GB 5009.97—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定第一法氣相色譜法，同時根據(jù)測定不確定度的評定方法，建立氣相色譜法測甜蜜素的數(shù)學(xué)模型，從稱量樣品、標(biāo)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品定容、測試過程中加標(biāo)回收率幾個方面對不確定度進行評價，根據(jù)對各分量不確定度結(jié)果分析可知，氣相色譜法測定雪糕中甜蜜素的不確定度主要來源為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合，其次是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制及檢測過程中回收率，此結(jié)論與眾多類似研究結(jié)果基本保持一致[12-16]。因此，在實際測定過程中，為提高檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，應(yīng)著重注意以下幾點：增加標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度測定的次數(shù)及平行樣品的測定；通過定期培訓(xùn)或練習(xí)的方式提高人員的技術(shù)水平，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；所使用的天平及量器應(yīng)及時定期檢定與維護，以保持設(shè)備的最佳狀態(tài)。