南亞實蠅轉錄組及嗅覺相關基因的初步分析

杜迎剛 季清娥 賴鐘雄

摘 ?要??南亞實蠅Bactrocera tau （Walker），是葫蘆科、茄科蔬菜和多種熱帶、亞熱帶果樹上的主要害蟲，抗逆性強，繁殖速度快，防治難度大。為挖掘可用于生物防治的分子靶標和探討副信息素類引誘劑對其作用的分子基礎，本研究采用Illumina HiSeq2500?PE125 bp測序技術對其混合樣進行轉錄組測序和生物信息學分析。經序列拼接獲得36 109條Unigenes，進一步與七大公共數據庫進行同源比對，注釋了21?127條Unigenes，其中在Nr數據庫中注釋成功的Unigenes數目最多，20?948條。Nr數據庫注釋的南亞實蠅B. tau Unigenes與地中海實蠅Ceratitis capitata同源性最高，達59.80%;與模式昆蟲黑腹果蠅Drosophila melanogaster的同源性次之，達14.86%。將Unigenes與GO數據庫比對發現，14?029條Unigenes根據功能分為了3個大類57個亞類;而與KOG數據庫比對結果為，13?479個Unigenes基因其功能屬于25個類別;進一步KEGG數據庫代謝分析表明，6442條Unigenes參與了5大類共152個代謝通路。基因注釋進一步篩選鑒定獲得了嗅覺相關基因528個，對其中氣味結合蛋白基因氨基酸序列的分析表明，其大多為具有6個保守的半胱氨酸位點的典型氣味結合蛋白，且與黑腹果蠅D. melanogaster、地中海實蠅C. Capicata、瓜實蠅B. cucuribitae、橘小實蠅B. dorsalis的氣味結合蛋白基因具有很高的同源性。這為南亞實蠅對副信息素類引誘劑反應的相關功能基因的挖掘及從嗅覺上尋求科學的防治措施提供了基礎數據。

關鍵詞 ?南亞實蠅;轉錄組分析;高通量測序;基因注釋;嗅覺基因中圖分類號??S433??????文獻標識碼??A

Preliminary Analysis of Transcriptome and Olfaction-related Genes in Bactrocera tau（Walker）

DU Yinggang^1，2， JI Qinge³， LAI Zhongxiong^2*

1. Facility Horticulture Laboratory of Universities in Shandong， Weifang University of Science and Technology， Shouguang， Shandong 262700， China; 2. Institute of Subtropical Pomology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?Bactrocera tau（Walker）?is a major pest to Cucurbitaceous and Solanceous vegetables and many fruits of tropical and subtropical areas. Prevention and control of it is very difficult due to its strong resistance and rapid reproduction. To seek effective?molecular targets for its control and the action mechanism of parapheromone，?transcriptome ofB. tauwas sequenced and related bioinformatics?analyzed using Illumina HiSeq2500?PE125 bp sequencing platform.?The clean reads were then?de novoassembled into?36 109 Unigenes.?Through a similarity search against seven public databases， 21?127 unigenes were annotated. Most unigenes were annotated to Nr database with a success number of 20?948，?and the unigenes ofB. Tauhad?the highest homology to those ofCeratitis capitate in?species distribution of unigenes in Nr database?（59.80%）， followed by 14.86% withDrosophila melanogaster. According to GO database， 14?029 Unigenes were classified into 3 categories?and 57 sub-types， while searching KOG database， 13?479 Unigenes were sorted in 25 functional groups. Metabolic analysis based on KEGG found 6442 Unigenes involved in 152 metabolite pathways in 5 classes. By further screening and identification， 528 olfaction-related genes ofB. tauwere obtained. Analysis of odorant binding protein genes ofB. taudemonstrated that most of them were typical with 6 conserved cysteine sites and with high homology to those ofD. melanogaster，C.capicata，B. cucuribita andB. dorsalis. These results?will provid basic information for the research of functional genes related to parapheromone treatment onB. tauas well as the establishment of control measures based on olfactories.

Keywords ?Bactrocera tau （Walker）;?analysis of transcriptome;?high-throughput sequencing;?gene annotation;?olfaction?genes

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.018

南亞實蠅Bactrocera tau （Walker），屬雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae，果實蠅屬Bactrocera Macquart^[1-3]，為害絲瓜、南瓜、苦瓜等13種瓜類，柑桔、芒果等共計70多種熱帶和亞熱帶瓜果。中國主要分布于廣東、廣西、海南、福建、云南、貴州、四川、湖北、浙江、江西等地^[4]。因其抗逆性強，個體食量大，發育歷期短，產卵期長，在很多地區其危害甚至超過橘小實蠅B. dorsalis（Hendel）^[5]。

目前，對南亞實蠅的防治措施主要借鑒橘小實蠅B. dorsalis和瓜實蠅B. cucuribitae的4步防控技術^[6-7]，其中性誘滅雄技術[指施用甲基丁香酚（methyl eugenol，簡稱ME）和誘蠅酮（cuelure，簡稱CUE）等對相關種類實蠅雄性具有強吸引作用的副信息素進行誘殺而降低雄蟲數量]從實蠅防治初期就一直發揮著重要作用^[8]。這2種物質對很多種類實蠅雄性都具有很強的引誘活性，但世界上沒有一類昆蟲像實蠅科昆蟲那樣對副信息素類物質的反應存在如此大差異^[9-10]。就南亞實蠅而言，對ME和CUE都有趨性，但ME/CUE對其引誘活性遠不如ME對橘小實蠅、CUE對瓜實蠅那樣強烈，這就導致了性誘滅雄技術在南亞實蠅上效果非常不理想，近年來，隨著高通量測序技術的發展，轉錄組分析逐漸成為昆蟲中尋求新的防治措施的有效手段^[11]。本研究以HiSeq2500高通量測序技術，首次對南亞實蠅進行了轉錄組測序研究，并以該轉錄本為依據對其嗅覺基因進行了挖掘，對OBPs進行了進化分析，為南亞實蠅嗅覺機理的探討和防治方法的尋求提供了重要數據。

1 ?材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?供試蟲源及飼養方法??室內大量飼養蟲源為福建農林大學益蟲研究所2013年建立的室內大量飼養種群，初始種群采自漳州為害絲瓜，本實驗用蟲為同地點同類寄主上野生蟲源連續復壯3次后的蟲源;輻照蟲源為用95 Gy/100 Gy劑量的⁶⁰Co輻照的羽化前2 d的蛹，羽化后正常人工飼料飼養的蟲源^[12];ME/CUE亞劑量誘導蟲源為取1 mL純的ME/CUE均勻涂抹盛在直徑60 mm培養皿中的人工飼料表面，于羽化后2 d（性成熟前）、5 d（發育關鍵日齡）、7 d（交配前）飼喂3次，連續誘導4代的蟲源。飼養方法參照文獻[13]。

1.1.2 ?測序樣本??正常飼養、輻照處理、CUE/ME誘導的南亞實蠅在1日齡（對ME有觸角電位反應，但沒趨性^[6]）、5日齡（對ME/CUE開始有趨性反應，但性未成熟）、10日齡（性成熟、交配前后）、17日齡（產卵后）、19日齡（部分實蠅開始出現2次交配）雌雄各取5只，平行取3管，液氮速凍后送至北京百邁客生物科技有限公司進行測序和分析，測序系統為HiSeq2500PE125測序儀。

1.2方法

1.2.1 ?RNA的提取??樣品充分研磨后用Trizol Reagent提取RNA，用Nanodrop分光光度計（德國Implen公司）、Qubit 2.0 熒光定量儀（美國Life Technologies公司）、Agilent 2100系統（美國Agilent Technologies公司）方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性。

1.2.2 ?文庫的構建、測序及數據的拼接、組裝??RNA樣品檢測合格后，按照Preparing Samples for Sequencing of mRNA試劑盒說明書（Illumina）構建測序文庫。當庫檢合格后，用Illumina?HiSeq?2500?的PE125?bp雙向測序技術對文庫進行測序。將測序得到堿基質量打分能達到或超過Q30高質量的Raw data進行數據過濾，去除其中接頭序列及低質量Reads，獲得高質量的Clean data。然后利用短reads組裝軟件Trinity將具有重疊區域的Clean data進行序列組裝，獲得Unigene庫。

1.2.3 ?Unigene功能注釋 ?使用BLAST軟件將Unigene序列與NR（Non-redundant protein database，非冗余的蛋白質序列數據庫）、Swiss-Prot（A?manually annotated and reviewed protein sequence database，人工注釋和審查蛋白質序列數據庫）、GO（Gene ontology，基因本體）、COG（Cluster of orthologous groups，蛋白相鄰類的聚簇）、KOG（Eukaryotic orthologous groups，真核生物同源組）、Pfam（Pfam database，同源蛋白家族數據庫）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）數據庫比對，通過基因的相似性進行功能注釋。

1.2.4 ?嗅覺相關基因鑒定分析 ?根據獲得的南亞實蠅轉錄組數據，對嗅覺系統相關基因進行統計分析。在NCBI、公共數據庫中搜索并與已登錄的黑腹果蠅D. melanogaster、地中海實蠅C. Capicata、瓜實蠅B. cucuribitae、橘小實蠅B. dorsalis等昆蟲的嗅覺相關基因的氨基酸序列進行BLAST比對，其中OBPs、CSPs結合其特有的結構通式^[14-15]進行進一步鑒定。鑒定出來的OBPs用MEGA5.0的Neighbor-joining方法構建進化樹，以Bootstrap=1000檢驗進化樹的可靠性。

2 ?結果與分析

2.1 ?RNA的提取與檢測

總RNA提取完整，OD_260/280為2.09，OD_260/230為0.91，28S/18S為1.4，濃度分別為2873.4?ng/μL，RNA純度和質量符合后續實驗要求。

2.2轉錄組測序及序列拼接組裝

對測序數據進行產出統計，共得到10.97 Gb Clean Data，Q30比例（測序錯誤率<0.1%）為90.05%（>90%），GC含量為43.58%。說明此樣品測序的數據符合要求，可以保證后續序列拼接組裝質量。

采用Trinity軟件把獲得的高質量測序數據進行序列組裝，取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene，得到36?109條Unigenes（表1）。其中N50和平均長度分別為1897和955.14?bp，說明此轉錄本文庫的測序和組裝結果較好，能夠進行后續生物信息學分析。

2.3??Unigenes的功能注釋

使用BLAST軟件將36?109條Unigenes與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG數據庫比對，獲得Unigene的注釋信息。最終獲得21?127條有注釋信息的Unigenes，占總Uni genes的58.51%，其中在NR數據庫中注釋成功的Unigenes數目最多，20?948條，占總數的58.01%;其后依次是Swiss-Prot有14 103條（39.06%），GO有14 029條（38.85%），KOG有13 479條（37.33%），Pfam有12 670條（35.09%），KEGG有6442條（17.84%）和COG有5984條（16.57%）（表2）。Unigene注釋到NR數據庫中的物種分布圖顯示（圖1），地中海實蠅C. capitata最多為13?526條，其后依次為黑?腹果蠅D.?melanogaster（3112條）、擬果蠅D. simulans（302條）、果蠅D. sechellia（196條）、中華支睪吸蟲Clo nor chis sinensis（192條）、家蠶Bombyx mori（176條）、黑果蠅D. virilis（173條）、非洲果蠅D. yakuba（159條）、羅阿絲蟲Loa loa（154條）、南美熱帶果蠅D. willistoni（153條）;其他物種2718條。

2.4 ?Unigenes的功能分類

對南亞實蠅轉錄組的Unigenes進行GO分析發現，在GO注釋的14 029條Unigenes中，注釋到生物學過程（Biological process）的基因最多（52 151條），其次是分子功能（Molecular functiion）（25 047條），細胞組分（Cellular component）的最少（18 959條）。在57個亞類中，以細胞過程、單生物過程、代謝過程在生物學過程中的比例較高，細胞和細胞部分在細胞組分中所占比例較高，蛋白結合和催化活性在分子功能分類中占有較高比例（圖2）。對南亞實蠅的Unigenes基于GO數據庫進行功能分類，可以從宏觀上認識南亞實蠅基因功能分布特征，為下一步目標基因的挖掘提供了便利。

將組裝得到的Unigenes與KOG數據庫比對，共有13 479個Unigenes基因被注釋，占37.33%，分為25個類別，最多的是一般功能預測基因（1681個），占12.47%;其次，是翻譯、核糖體結構與合成基因（711個），占5.27%;第三，是復制、重組和修復基因（629個），占4.67%;第四，是翻譯后的修飾、蛋白質轉化、伴侶基因（584個），占4.33%;最少的是核酸結構基因（2個），占0.01%，細胞外結構基因（0個）（圖3），說明了南亞實蠅Unigenes功能分類的總體情況。

KEGG數據庫對南亞實蠅的Unigenes可能參與或涉及的代謝途徑進行分析表明，6442個Unigenes參與了細胞過程（cellular processing）、環境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information proce ssing）、代謝（metabolism）和生物系統（organismal systems）5大類共152個代謝通路，其中注釋基因數最多的10個代謝通路依次為：核糖體（276個）、氧化磷酸化（268個）、內質網蛋白加工（246個）、RNA運輸（233個）、嘌呤代謝（181個）、剪接體（174個）、細胞內吞作用（146個）、泛素介導的蛋白質降解（143個）、溶酶體（141個）和吞噬體（133個）（表3）。

2.5嗅覺相關基因分析

通過對7大公共數據庫同源比對和注釋分析，528個嗅覺相關基因在南亞實蠅轉錄組中獲得鑒定。其中包括34個OBPs、3個化學感受蛋白基因[Chemosensory protein （CSP） genes]、20個嗅覺受體基因[Olfactory receptor （Or） genes]、43個離子型受體基因[Ionotropic receptor （IR） genes]、204個昆蟲觸角G蛋白基因（GTP binding protein genes）、5個昆蟲感覺神經元膜蛋白[Sensory neuron membrane proteins （SNMPs）]基因和219個氣味降解酶基因[Odor degrading enzymes （ODE） genes]（表4）。對OBPs的分析發現，28條具有完整的開放閱讀框，進一步氨基酸序列分析表明，2條屬于Minus-OBPs，1條為Dimer-OBPs，1條為“Plus-C”OBP，24條為典型OBPs;對30條結構較完整的南亞實蠅OBPs序列與黑腹果蠅D. melanogaster（58條）、瓜實蠅B. cucuribitae（34條）、地中海實蠅C. capitata（28條）、橘小實蠅B. dorsalis（47條）OBPs序列進行進化分析表明（圖4），B. tauOBP多數至少與一種實蠅OBP同源物聚類在一支，且擁有80%以上的序列一致性，僅有極個別B.tauOBP與同一支上的實蠅OBP序列一致性較低，如C29372.graph_c0與BdorOBP（AKM45842.1）序列一致性僅為44%且在進化樹中形成一個獨立的小分支，表明不同種類的實蠅OBPs出現了各自的分化。

3 ?討論

副信息素類引誘劑從發現其對實蠅相關種類雄性具有強引誘活性開始，就一直在實蠅綜合防治和監控上發揮著重要作用^[8]，在很多地區甚至是唯一的防治措施。但在施用過程中發現：相關實蠅種類的雄蟲取食少量的引誘劑不但不會死亡還可大幅度提高其交配競爭能力以及對雌性的吸引力^{[6， 16]};實蠅經過一段時間的ME處理后不但有助于性成熟^[17]，且其當代和后代雄性對ME的敏感性下降，有些學者據此擔心副信息素類誘劑不合理的使用會導致田間出現其抗性種群^[8];實蠅輻照成為不育雄蠅后，對引誘劑的反應活性降低且開始反應的日齡推遲，飼喂一定量的引誘劑后交配能力得到一定程度的恢復^[18]，據此副信息素類引誘劑被廣泛應用到實蠅SIT項目中^[19]。為探討副信息素類引誘劑使用對南亞實蠅嗅覺相關基因的影響，進而指導其在實蠅監測、防治中的合理應用，本研究綜合考慮轉錄組測序的特點^[20]和南亞實蠅當時的發育歷期^[21-22]，對正常飼養、輻照處理、副信息素類引誘劑誘導下的蟲源在不同日齡進行了混合取樣和測序。

該樣品通過組裝共獲得36?109條Unigenes，其中N50長度為1897?bp，獲得了測序和組裝結果較好，能滿足后續對功能基因挖掘要求的轉錄本文庫。進一步將得到的Unigenes通過Blast與7大公共數據庫進行同源性搜索獲得21?127條Unigenes（58.51%）的注釋，其中在NR注釋成功的Unigenes數目最多，20?948條（58.01%），且在NR數據庫中，注釋到地中海實蠅C. capitata上的Unigenes最多，為12?526條，占在NR數據庫中總注釋Unigenes的58.80%;注釋到黑腹果蠅D. melanogaster上的Unigenes為3112條，占在NR數據庫中總注釋Unigenes的14.86%，這不但說明了地中海實蠅與南亞實蠅的親緣關系較近，也進一步說明了此轉錄本文庫組裝和注釋的正確，還有，這2種昆蟲都有基因組數據，這為下一步南亞實蠅功能基因的挖掘和生物信息學分析提供了便利。同時，利用GO、KOG數據庫對南亞實蠅Unigenes進行了基因功能分類和功能預測，用KEGG數據庫對南亞實蠅6442條Unigenes進行了代謝通路初步分析，這為下一步挖掘功能基因及開展靶標基因的克隆及功能驗證提供了基礎數據。

嗅覺在昆蟲寄主定位與選擇、躲避天敵、尋找配偶、產卵行為等生命活動中發揮著感知寄主揮發物、昆蟲利它素、昆蟲信息素等氣味物質的重要作用，昆蟲在長期進化過程中形成了一套高度專一、極其靈敏、復雜的嗅覺系統，系統中涉及OBP、CSP、OR、SNMP、IR、G-Protein和ODE等多種蛋白家族^[23]。其中OBP的功能是將外界疏水性的氣味分子運載到嗅覺神經樹突膜上的感覺受體（OR），是昆蟲實現嗅覺信號轉導的第一步，也是目前研究較多、機理了解最多的一步。在該轉錄本中，我們初步篩選出了528個嗅覺相關基因，其中包括34個OBPs、3個CSPs、20個Ors、43個IRs、204個G蛋白基因、5個SNMPs和219個ODEs。204個G蛋白基因中包括13個小G蛋白基因;ODEs包括細胞色素P450基因150個，谷胱甘肽S-轉移酶基因（Glutathione S-transferase）22個，醛脫氫酶基因（Aldehyde dehydrogenase，ALDHs）25個、醇脫氫酶基因（Alcohol dehydrogenase，ADHs）22個。34個OBPs中有28條具有完整的開放閱讀框，氨基酸序列大多符合Cys-X_20-66-Cys-X₃-Cys- X_21-43- Cys-?X_8-14-Cys-X₈-Cys、Cys-X_15-39-Cys-X₃-Cys- X_21-44Cys- X_7-12-Cys-X₈-Cys或X_22-68-Cys-X_25-68- Cys-X₃-?Cys–X_31-46-Cys-X_8-29-Cys-X_8-9-Cys-X_5-71典型OB Ps的結構特點^[24-25]，與黑腹果蠅D. melanog aster、瓜實蠅B. cucuribitae、地中海實蠅C. capi ta ta、橘小實蠅B. dorsalis在NCBI上已登錄的所有OBPs中至少有一條同源物聚類在同一支，且擁有80%以上的序列一致性，這為下一步借鑒這些實蠅在基因組方面的研究成果進一步挖掘研究南亞實蠅OBPs及其他功能基因提供了依據，也為下一步以該蛋白為基礎，探討南亞實蠅對副信息素的引誘機理并篩選新的引誘成分提供了基礎數據。

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