基于高通量測序技術分析2種菌草根際土壤細菌群落多樣性

葉文雨 廖海萍 許鈺瀅 謝序澤 倪明月 胡紅莉 余文英 魯國東

摘 ?要??為詳細了解福州菌草基地巨菌草和綠洲一號2種菌草的根際土壤細菌群落組成與結構，本研究應用高通量測序技術，分析了巨菌草和綠洲一號根際土壤細菌群落結構及多樣性。結果表明，菌草根際土檢測到細菌類群主要的優勢菌門為酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）;主要的優勢菌綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria-6）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteriia）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）;主要的優勢屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、不動細菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。綠洲一號、巨菌草及其對照根際土壤細菌Shannon-Wiener指數分別為9.05、8.733、7.61;巨菌草、綠洲一號及其對照根際土壤細菌Simpson多樣性指數分別為0.01、0.014、0.037;巨菌草、綠洲一號及其對照根際土壤細菌Chao1指數分別為3145.320、3647.482、2329.344。Alpha多樣性指數分析得出，在3個土壤樣品中，綠洲一號根際土Shannon指數最大，對照土壤Shannon指數最小，對照土壤Simpson指數最大，綠洲一號Simpson指數最小，說明菌草根際土壤細菌群落多樣性高于非根際土土壤細菌群落多樣性，綠洲一號根際土土壤細菌群落多樣性略高于巨菌草根際土壤細菌群落多樣性，這些結果為進一步研究土壤微生物提供了理論基礎。

關鍵詞 ?菌草;根際土壤;細菌群落多樣性;高通量測序中圖分類號??S154.3; S54??????文獻標識碼??A

Rhizosphere Soil Bacterial Community of Juncao?by High-throughput Sequencing Techniques

YE Wenyu^1，2， LIAO Haiping²， XU Yuying²， XIE Xuze²， NI Mingyue³， HU Hongli³， YU Wenying²，LU Guodong^1，3*

1. National Engineering Research Center of Juncao Technology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?Diversity analyses were investigated by the high-throughput sequencing to study the composition and diversity of bacterial communities in the rhizosphere soil ofPennisetum giganteumandArundo donax cv.?Lvzhou?No. 1. Results showed that the dominant phyla of all samples were Acidobacteria， Proteobacteria， Actinobacteria， Firmicutes， Chloroflexi， Gemmatimonadetes， Nitrospirae， Verrucomicrobia， Planctomycetes. At the class level， nine dominant species were found in all samples， such as Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Bacilli， Actinobacteria， Acidobacteria-6， Betaproteobacteria， Acidobacteriia， Ktedonobacteria， Deltaproteobacteria. At the genus level， dominant species were found in all samples， such asStaphylococcus，Saccharopolyspora，Paenibacillus，Serratia，Streptococcus，?Rhodoplanes，Acinetobacter，Pseudomonas. The Shannon-Wiener from the samples was 9.05， 8.733， 7.61， respectively. The Simpson index from the samples was 0.01， 0.014， 0.037， respectively. The Chao1 index from the samples was 3145.320， 3647.482， 2329.344， respectively. The result of Alpha diversity analysis showed that the Shannon index， Simpson index and Chao1 index of Juncao?increased. The diversity index analysis showed that in the soil samples， the lowest bacterial diversity was in the experimental control soil and the highest bacterial diversity was in theA.?donax cv.?Lvzhou?No. 1?rhizosphere soil. The bacterial diversity in theA.?donax cv.?Lvzhou?No. 1?rhizosphere soil was slightly higher than that in thePennisetum giganteumrhizosphere soil.

Keywords Juncao; rhizosphere soil; diversity of bacterial communities; high-throughput sequencing

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.016

根際（rhizosphere）是指受植物根系活動的影響，在物理、化學和生物學性質上不同于土體的那部分微域土區^[1-2]。根系和根際土壤微生物形成了互惠的關系，植物根系分泌物影響根際土壤微生物的群落，反之，根際土壤微生物影響植物根系的生長、對營養的吸收等^[3-6]。根際土壤微生物還可以增加植物的抗逆境能力及改善土壤酸堿度等^[7-8]。近年來，諸多學者對植物根際土壤微生物開展了相關研究工作^[9]。研究表明，分離自香蕉根際土的芽孢桿菌PAB-1、PAB-2不僅能有效促進其苗期植株生長，還能抑制香蕉枯萎病的發生^[10]。研究表明，熒光假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌對南方紅豆杉苗期的生長具有促生作用^[11]。巨菌草和綠洲一號^[12]是可以作為栽培食用菌、藥用菌的培養基的草本植物，多年研究發現，菌草營養成分豐富，產量高，適應性廣，抗逆性強，可以作為動物的飼料，種植菌草可以凈化和改良土壤，治理水土流失，防沙治沙，改善生態環境等作用。菌草在國內廣泛種植，由于福州是菌草引種的發源地，福州有許多地方均種植了菌草。基于菌草的廣泛作用及根際微生物的巨大作用，因此研究菌草根際微生物是十分必要的。本文采用高通量測序技術，研究巨菌草和綠洲一號根際土壤中細菌的物種組成、群落結構及多樣性，為進一步探討土壤微生物的功能以及微生物資源的開發利用提供理論依據。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1??研究區概況??福州市倉山區菌草基地位于福州市南部南臺島上，海拔多在600～1000 m，亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為20～25?℃，年平均降水量為900～2100 mm。

1.1.2??試驗材料??巨菌草（Pennisetum giganteum）和綠洲一號（Arundo donax cv.?Lvzhou?No. 1）的根際土壤和非根際土壤。由于巨菌草和綠洲一號生長在同一試驗基地，因此對照采用了合并2個非根際土樣的方法。具體樣品編號為：FSLV（綠洲一號根際土）;FSJU（巨菌草根際土）;FSCK（對照非根際土）。土壤樣品采集采用全妙華等^[13]的取樣方法。本試驗3次生物學重復。

1.1.3 ?儀器與設備??NanoDrop 2000c型超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司。EDC810型PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ?土壤總DNA提取??采用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒（美國MP Biomedicals），參照提取說明進行土壤總DNA的提取^[14]，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，同時采用超微量分光光度計檢測提取DNA的濃度，提取合格的DNA于?20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2??16S rRNA PCR擴增及高通量測序??以稀釋后的土壤微生物基因組DNA為模板，采用16S rRNA基因V4區特異性引物515F（GTGCC AGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHV GGGTWTCTAAT）進行擴增^[15-16];PCR反應體系為Phusion Master Mix（2×）15 μL、Primer（2?μmol/L）3 μL、DNA模板10 μL（5～10 ng）、ddH₂O 2 μL。反應程序：98?℃預變性1 min;30個循環包括（98?℃，10 s;50?℃，30 s;72?℃，30 s）;72?℃，5 min。同時每個樣品做3個技術重復，將同一樣品PCR產物混合后經電泳檢測、割膠純化、濃度檢測等操作后，將樣品送到諾禾致源生物有限公司，使用New England Biolabs公司的NEB Next^?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測，合格后，使用HiSeq進行上機測序。

1.2.3??序列生物信息學分析??測序得到的原始數據（raw data）^[17]，進行拼接、過濾，得到有效數據（clean data）。基于有效數據進行OTUs（ope ra ti onal taxonomic units）聚類和物種分類分析，根據OTUs聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性、Venn圖等分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。

2??結果與分析

2.1 ?2種菌草土壤微生物群落結構變化

2.1.1 ?門水平群落結構分析??由圖1可知，巨菌草和綠洲一號根際土壤細菌群落在門類水平上主要類群為酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes），相對豐度分別為87.60%、97.67%、31.70%、21.39%、13.28%、10.46%、5.98%、7.59%、7.01%。巨菌草和綠洲一號根際土變形菌門（Proteobacteria）是優勢菌門，其非根際土放線菌門（Actinobacteria）是優勢菌門。

2.1.2 ?綱水平群落結構分析??由圖2可知，巨菌草和綠洲一號根際土壤細菌群落在綱類水平上主要類群為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria-6）、β-變形菌綱（Betaprote obacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteriia）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、δ-變形菌綱（Deltapro teobacteria）相對豐度分別為34.08%、29.58%、19.70%、16.30%、16.30%、17.63%、12.00%、7.25%、15.87%。巨菌草和綠洲一號根際土γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）是優勢菌綱，其非根際土DA052是優勢菌綱。

2.1.3??屬水平群落結構分析??由圖3可知，巨菌草和綠洲一號根際土壤細菌群落在屬水平上主要類群為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、類芽孢桿菌屬（Paeni bacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、鏈球菌屬（Strep tococcus）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、不動細菌屬（Acinetobacter）、未確定屬（Candidatus Solib acter）、未確定屬（Candidatus Koribacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas），相對豐度分別為8.92%、5.49%、1.71%、2.93%、5.52%、4.89%、2.01%、3.61%、3.31%、0.98%。巨菌草和綠洲一號根際土葡萄球菌屬（Staphylococcus）是優勢菌屬，其非根際土未確定屬（Candidatus Koribacter）是優勢菌屬。

2.2 ?2種菌草土壤細菌群落豐度和多樣性估計

Alpha多樣性指數可以反映各群落內微生物多樣性的豐富度。表1是不同處理土壤樣本的Alpha多樣性指數統計表，ACE指數和Chao1指數是2種用于估計群落中含OTU數目的微生物多樣性指數的方法，在生態學中常用來估計物種的總數。由表1可以看出，巨菌草和綠洲一號根際土壤樣本的ACE指數和Chao1指數均高于對照，表明巨菌草和綠洲一號根際土壤樣本中土壤的細菌豐度高于非根際土。巨菌草根際土壤樣本的ACE指數和Chao1指數均高于綠洲一號，表明巨菌草根際土壤樣本中細菌總數高于綠洲一號根際土細菌總數。菌草根際土與非根際土的覆蓋率都在90%以上，能較好的反映樣本的真實情況。綠洲一號土壤樣本的Shannon-Wiener指數最大，說明細菌群落多樣性程度越高，Simpson指數最低的為綠洲一號，Simpson指數值越小，說明細菌群落多樣性越大。綜合以上分析結果說明，菌草根際土壤細菌的多樣性和豐度都比非根際土壤細菌的高。巨菌草和綠洲一號根際土壤細菌的多樣性和豐度也略有不同，綠洲一號的細菌群落多樣性略高于巨菌草。

2.3細菌群落的相關性分析

圖4為巨菌草和綠洲一號根際土壤細菌的OTU Venn圖由圖4可知，巨菌草和綠洲一號及其對照的土壤樣本中分別檢測到3701、3610、2947個OTU，其中共有的OTU為2310個，特有的OTU依次為427、322、157個，分別占巨菌草、綠洲一號及其對照土壤樣本中總OTU的11.54%、8.92%、5.33%。

2.4基于OTUs的主坐標分析

為了更清晰地了解不同菌草間土壤微生物群落組成結構的特征，通過分析不同樣本OTU組成，對樣地的土壤細菌群落數據實施了主坐標分析（PCoA），不同菌草根際土間的樣本表現出分散或聚集的分布情況，結果如圖5所示，以兩坐標軸的零基準線為參考進行PCoA分析。圖5中綠洲一號與PC2軸相距均較近，說明綠洲一號中細菌菌群結構受主成分PC2的影響大，PC2一種主成分對樣品中菌群結構的影響達到總影響因子的11.97%，圖5中巨菌草與PC1軸相距均較近，說明巨菌草中細菌菌群結構受主成分PC1的影響大，PC1一種主成分對樣品中菌群結構的影響達到總影響因子的80.91%;而對照與PC1、PC2軸相距較遠，說明對照樣品中細菌菌群結構受主成分PC1和PC2的影響不大。因此，通過主坐標分析可見，細菌群落PC1和PC2分別解釋80.91%和11.97%差異性，綠洲一號、巨菌草及對照沒有聚在一起，說明微生物差異大。

2.5優勢細菌的系統發育分析

選取相對豐度排名前10的屬所對應的OTUs數據進行多序列比對，并繪制了系統發育進化圖（圖6）。圖6展示了菌草根際與非根際土壤樣品中相對豐度排名前10的屬細菌所對應的OTUs系統發生關系數據，表明菌草根際與非根際土壤樣品中主要分布于以下10個屬：葡萄球菌屬（Sta phy lococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、紅游動菌屬（Rhod o pl anes）、暫定菌屬（Candidatus Solibacter）、暫定菌屬（Candidatus Koribacter）、沙雷氏菌屬（Serr at ia）、硫酸鹽還原菌屬（Desulfovibrio）、不動細菌屬（Acinetobacter）、類芽孢桿菌屬（Paen iba cillus），其中有2個暫定菌屬。

3??討論

近年來，高通量測序技術已廣泛用于植物根際微生物群落的研究。本研究采用高通量測序技術對巨菌草和綠洲一號根際土壤及其非根際土細菌群落多樣性進行了研究，得出了巨菌草和綠洲一號根際土壤及其非根際土細菌群落所屬的門、綱、目、科、屬、種不同分類水平上的優勢類群及其相對豐度。本研究結果表明，在門的水平上，巨菌草和綠洲一號根際土壤及其非根際土細菌群落前3優勢菌門為酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actin oba cteria）;放線菌是植物根際土中一類重要的微生物，在促進植物生長方面，防治病害方面起到重要作用^[18-19]。在綱水平上，其前3優勢菌綱為g-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、a-變形菌綱（Alpha proteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）;研究表明，玉米根際細菌中g-變形菌綱（Gamm a proteobacteria）、a-變形菌綱（Alphaprot eobacteria）和酸桿菌（Acidobacteria）所占比例較高^[20-21]。在屬水平上，其前3優勢菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Strep tococcus）、糖多孢菌屬（Sacchar opo lyspora）。研究結果說明，巨菌草和綠洲一號根際土及非根際土菌落多樣性不同，可能是由于不同植物根系對根際土細菌群落影響不同，根系分泌物的數量與質量是影響根際細菌群落的重要因素。

研究表明，沙雷氏菌屬、假單孢菌屬、芽孢桿菌屬可以產生生長素、赤霉素等促進植物生長，可以固氮、溶磷等促進植物對養分的吸收，進而改善根系構型、減少肥料的施用^[22-26];假單孢菌屬可以提高植物的耐鹽性^[27-28];總之，根際微生物可以調節和改善土壤的微生態環境。多樣性分析結果表明，巨菌草和綠洲一號根際土細菌群落的多樣性與豐富度均略高于非根際土細菌群落的多樣性與豐富度。綠洲一號根際土細菌群落多樣性略高于巨菌草根際土細菌群落，在同樣的生長環境條件下，這可能與植物根系分泌物不同有關。本研究結果為進一步深入研究菌草根際土微生物功能提供了理論數據。

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