柱花草苯丙氨酸解氨酶（SgPALs）對生物脅迫與非生物脅迫的響應

郭鵬飛 雷健 羅佳佳 劉攀道 虞道耿 羅麗娟

摘 ?要??本研究以熱研2號柱花草為材料，分析其苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、總酚含量、類黃酮含量、總抗氧化能力和SgPALs基因表達模式對生物脅迫（炭疽菌侵染）與非生物脅迫（干旱和鹽脅迫）的響應。結果表明，在3種脅迫處理下，柱花草不同組織部位的PAL活性增加18.58%～123.56%，且葉片的總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力分別增加65.11%～68.00%、51.00%～76.87%和83.00%～262.08%，差異顯著。在干旱和鹽脅迫處理下，根系的總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力也顯著提高43.77%～51.12%、45.46%～45.98%和60.45%～97.89%。隨后對SgPALs的表達模式分析表明，除SgPAL4外，其他3個SgPALs受炭疽菌侵染誘導上調表達;在干旱脅迫下，根系中4個SgPALs均增強表達，但葉片中僅SgPAL1和SgPAL4上調表達;在鹽脅迫下，根系中4個SgPALs也都上調表達，葉片中除SgPAL3下調表達外，其他3個SgPALs增強表達。綜上所述，在遭受生物脅迫和非生物脅迫時，柱花草中的SgPALs基因表達及PAL酶活性升高，伴隨著總酚與類黃酮含量的同步升高，表明其對環境脅迫的抗性升高。

關鍵詞 ?柱花草;苯丙氨酸解氨酶;類黃酮;生物脅迫;非生物脅迫中圖分類號??S59??????文獻標識碼??A

Response of Phenylpropane Ammonia-lyase on Biotic and Abiotic Stress in Stylosanthes

GUO Pengfei¹， LEI Jian¹， LUO Jiajia^1，?2， LIU Pandao²， YU Daogeng²， LUO Lijuan^1*

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan?570228， China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?Changes in?PAL activity， total phenol?and?flavonoid?content， total antioxidant capacity andSgPALsexpression pattern were analyzed?to study the responses ofStylosanthesguianensiscv. Reyan2?to?biotic （infectied?byColletotrichum gloeosporioides） and abiotic （drought and salt） stresses.?PAL activity increased by 18.58%-123.56% in different tissues under treatments of the three different stresses. The total phenol and total flavonoid?content，?and the total antioxidant capacity significantly increased by?65.11%-68.00%，?51.00%-76.87% and 83.00%-262.08%， respectively， in the leaf by pathogen infection， drought and salt stress， and similarly increased by 43.77%-51.12%，?45.46%-45.98% and 60.45%-97.89%， respectively， in the root by pathogen infection， drought and salt stress.PAL gene?expression patterns?showed that the clonedSgPALsgenes， exceptSgPAL4， were up-regulated by anthrax infection?in the leaf. TheSgPALsgenes were up-regulated?by drought stress inthe root while onlySgPAL1andSgPAL4were up-regulated in?the?leaf.?Under salt stress， theSgPALsgenes were up-regulated in?the?root， while theSgPALsgenes， exceptSgPAL3， were down-regulated in the leaf.

Keywords ?Stylosanthes guianensis; phenylalanine ammonia-lyase; flavonoids; biotic stress; abiotic stress

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.011

全世界范圍內，由于病原菌侵染、動物取食、干旱、鹽害、低溫等各種生物和非生物脅迫導致作物產量嚴重下降^[1]。其中，病原菌侵染是較典型的生物脅迫之一，包括大豆疫霉病^[2]、小麥紋枯病^[3]、水稻稻瘟病^[4]等，而鹽害和干旱是限制農作物生產的典型非生物脅迫^[5-6]。逆境環境下，植物物質代謝和能量代謝平衡遭受破壞，電子傳遞鏈缺少下游電子受體而被阻斷，導致大量活性氧累積（reactive oxygen species， ROS），例如H₂O₂、O₂^?和OH^?等，氧化損傷脂質、細胞膜、蛋白質、DNA等^[7]。Mittler^[8]報道，植物產生了10種抵抗ROS的策略，主要包括阻止ROS的再產生和清除已有的ROS，其中阻止ROS產生的機制有葉片卷曲、C4或景天酸代謝途徑和抑制光合作用等，而清除機制包括酶系統的抗氧化酶（如CAT、POD、SOD等）和非酶系統的抗氧化次級代謝物（如多酚、類黃酮、類胡蘿卜素等）。

苯丙烷代謝途徑是植物重要的三大次生途徑之一，其上游起始是以L-苯丙氨酸或酪氨酸為底物，在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase， PAL， EC 4.3.1.5）的催化下非氧化性脫氨，產生反式肉桂酸，最終生成香豆酰輔酶A，并以此為底物進入下游的類黃酮代謝、木質素代謝、香豆素代謝等分支^[9]。近年來，基于基因組學技術的快速發展，大量研究從轉錄、蛋白以及代謝水平均闡明植物苯丙烷代謝及下游代謝物廣泛參與各種逆境脅迫^[10]。PAL是苯丙烷代謝的關鍵限速酶，其編碼基因屬于多基因家族成員，不同物種其拷貝數各異，從幾個成員（擬南芥含4個）至幾十個（西紅柿含有26個）^[11]。研究發現PAL轉錄水平受環境刺激的調控，且各同源基因具有不同分工，例如擬南芥中，缺氮能特異誘導4個同源基因的AtPAL1和AtPAL2表達，而雙突變體擬南芥pal1/pal2不能合成類黃酮，證明AtPAL1和AtPAL2主要介導下游類黃酮代謝^[12]。Tonnessen等^[13]利用數量性狀基因座（quantitative trait loci， QTL）定位到OsPAL與水稻抗病性相關，遺傳證據表明OsPAL4參與水稻對細菌性枯萎病、稻瘟病和葉鞘枯萎病的防御反應。此外，類黃酮本質為多酚類物質，具有一個或多個酚羥基基團，顯示較強的還原性，能消除環境脅迫產生的ROS。Feucht等^[14-15]報道，高溫和干旱能改變細胞核中類黃酮的含量，而核定位的類黃酮主要作用是保護處于有絲分裂階段無核膜包圍的染色體免受氧化傷害。

柱花草（Stylosanthesspp.）是重要的多年生豆科牧草，具有耐貧瘠和耐酸性土壤等特點^[16]，但生物脅迫（炭疽病）和非生物脅迫（干旱、鹽害）嚴重限制了柱花草的種植和生產^[17-19]。目前，對柱花草響應干旱、鹽害、炭疽病脅迫在形態、生理、生化等方面已有文獻報道，且抗氧化機制主要集中在酶系統方面^[17-19]，但其抵抗逆境脅迫的非酶系統生理及分子機制鮮有報道。本課題組前期研究發現，接種炭疽菌的柱花草葉片其脅迫響應基因SgPAL1顯著上調，但其酶活及介導的下游類黃酮代謝等支路如何變化尚不清楚^[20]。因此，本研究通過分析干旱、鹽害和接種炭疽菌脅迫下，柱花草PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的變化以及SgPALs的表達模式，以期解析以下2個問題：（1）SgPAL介導的苯丙烷代謝及下游酚類代謝對生物脅迫和非生物脅迫的響應機制如何，是否一致？（2）逆境脅迫下，柱花草SgPAL基因家族成員的表達模式如何？本研究為柱花草抗逆品種的選育和基因改良提供理論基礎。

1??材料與方法

1.1材料

供試柱花草種質為熱研2號（Stylosanthes guianensiscv. Reyan2），種子來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所牧草業研究室。

1.2方法

1.2.1 ?試驗設計??本試驗在海南大學熱帶農林學院科研基地的大棚進行。熱研2號種子經80 ℃熱水浸泡2 min，冷卻至室溫后，育苗盒播種，以腐殖土∶蛭石按1∶1混勻為基質，幼苗正常培養4～5周。分別進行接種炭疽菌、干旱、鹽害處理。每種處理均設置3個生物學重復。

接種炭疽菌處理。接種所用菌株為實驗室課題組前期從海南島采集，分離并純化的膠孢炭疽菌菌株^[21]。參考Wang等^[20]方法，制備接種的炭疽菌孢子懸浮液，即配置PDA培養基，劃板接種膠孢炭疽菌，置于28 ℃暗培養約10?d，無菌水洗脫孢子。使用血球計數板，控制孢子濃度在10⁶/mL，并加入0.2% Tween20。同樣，實驗設置2個處理，用100 mL孢子懸浮液噴灑熱研2號柱花草直到葉片上凝成水珠，對照用含有0.2% Tween20的100?mL無菌水處理。接種60?h后，收獲材料。

干旱處理。選取長勢基本一致正常的柱花草幼苗，澆灌500 mL的含10%?PEG-6000霍格蘭氏營養液，模擬干旱條件，對照用500 mL霍格蘭氏營養液澆灌。處理7 d后收獲樣品。

鹽害處理。取土培的柱花草幼苗，澆灌500 mL的含0.5% NaCl霍格蘭氏營養液，對照用500 mL霍格蘭氏營養液澆灌。處理3 d后收獲樣品。

1.2.2??PAL酶活性測定??采用南京建成生物工程研究所的試劑盒（中國，貨號為A137），PAL可以催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反式肉桂酸在290 nm處有最大吸收值，通過測定吸光值變化值計算PAL活性。具體操作步驟參考該試劑盒的說明書。

1.2.3??總抗氧化能力（T-AOC）測定??采用南京建成生物工程研究所的試劑盒（中國，貨號為A015），植物體內的抗氧化物質，可以將Fe³⁺還原成Fe²⁺，Fe²⁺可與菲啉類物質形成絡合物，通過比色測出抗氧化能力。具體操作步驟參考試劑盒的說明書，單位按每毫克蛋白中的酶活力單位數計算（U/mg）。

1.2.4??總酚含量測定??參考Chang等^[22]方法，采用Folin-Ciocalteu法進行比色分析，即通過磷酸緩沖液提取總酚后，加入Folin-Ciocalteu顯色劑，在765 nm波長處測定吸光度，同時以沒食子酸繪制標準曲線，定量總酚含量。

1.2.5??類黃酮含量測定 ?采用Uarrota等^[23]方法，略有改動。采用磷酸緩沖液提取類黃酮后，配置2 mL的反應體系：100 μL提取液，0.5 mL 95%乙醇、0.1 mL 1 mol/L乙酸鉀、0.1 mL 10% AlCl₃溶液，以及1.2 mL蒸餾水。混勻后，反應30 min，檢測415 nm波長處的吸光度，并以槲皮素繪制標準曲線，進行定量。

1.2.6SgPALs的克隆和Real-time PRC分析??參照TRIzol（Invitrogen Inc，美國）方法提取柱花草總RNA，并用TaKaRa公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第一鏈，?20 ℃保存備用。根據柱花草轉錄組測序結果^[24]，利用Oligo 7軟件設計SgPAL基因全長引物和定量引物（表1），以cDNA為模板，采用高保真聚合酶Phusion（Thermo）擴增SgPAL的全長片段。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行切膠回收純化的目的片段，連接到pEASY-T1（TaKaRa，日本）載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，測序分析后獲得4個SgPAL基因全長cDNA序列。此外，參考Liu等^[25]方法，以柱花草看家基因SgEF-1α為內參，運用SYBR? Premix Ex Taq? II（TaKaRa，日本）定量試劑盒進行Real-time PCR分析，用Rotor-Gene Q（Qiagen， Hilden，德國）進行反應。20 μL的反應體系為：10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，6.4 μL Mili-Q無菌水，0.8 μL 10?μmol/L引物，2 μL濃度為200 ng/μL的cDNA模板。反應程序為：95 ℃?1 min，94 ℃?15 s，60 ℃?15 s，72 ℃?30 s，循環40次。相對表達量=目的基因表達量/看家基因（SgEF-1α）表達量，定量引物如表1所示。

1.2.7SgPALs的生物信息學分析??運用DNAMAN進行多序列比對分析，采用MEGA（v5.50）進行系統進化樹分析，利用NCBI網站進行保守結構域分析。

1.3數據處理

采用Microsoft Office 2016軟件對本研究相關數據進行分析并繪制圖表，以平均值和標準誤表示檢測結果，并使用IBM SPSS Statistics 20（SPSS Institute，美國）軟件進行統計分析，對同一組織不同處理的樣品運用獨立樣本T檢驗分析差異的顯著性。

2??結果與分析

2.1相關生理指標測定

2.1.1 炭疽菌侵染對柱花草PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的影響??由圖1可知，接種炭疽菌后，柱花草葉的PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力與對照相比均極顯著提高（P<0.01），分別提高了41%、68%、51%和83%。在柱花草莖中，炭疽菌侵染后僅PAL活性和總抗氧化能力分別極顯著提高48%和51%（P<0.01），但總酚含量和類黃酮含量無顯著變化。以上結果表明，柱花草的葉片和莖通過增強抗氧化能力抵抗炭疽菌的侵染，葉片PAL參與調控總酚和類黃酮代謝對炭疽病的響應。

2.1.2 ?干旱脅迫對柱花草PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的影響??如圖2所示，與對照相比，干旱脅迫下（PEG處理）柱花草葉、莖和根中的PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力均顯著提高（P<0.05）。其中，在PEG處理下，葉、莖和根的PAL活性分別提高了46.12%、85.21%和123.56%;總酚含量分別提高了65.11%、123.33%和51.12%;類黃酮含量分別提高了51.83%、133.68%和45.46%;總抗氧化能力分別提高了119.15%、31.25%和60.45%。以上結果顯示，柱花草PAL調控下游的總酚和類黃酮代謝，通過提高抗氧化能力來適應干旱脅迫。

2.1.3 ?鹽脅迫對對柱花草PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的影響??如圖3所

示，與對照相比，當遭受鹽脅迫時（NaCl處理），柱花草的PAL活性和類黃酮含量均顯著提高（P<0.05）。其中，葉、莖和根的PAL活性分別提高了45.44%、18.58%和45.51%，類黃酮含量分別提高了76.87%、18.51%和45.98%。NaCl處理下，總酚含量和總抗氧化能力僅在葉和根中顯著提高，而對莖無影響。以上結果表明，PAL介導的代謝途徑參與了柱花草對鹽脅迫的響應。

2.2SgPALs序列的克隆及生物信息學分析

根據柱花草4個PAL基因序列，并設計了全長引物（表1），以cDNA為模板，擴增出4個SgPAL基因的開放閱讀框（open reading frame， ORF）序列，經測序分析發現所有基因全長序列與轉錄組結果完全一致，SgPAL1、SgPAL2、SgPAL3、SgPAL4這4個基因的大小依次為2145、2073、2133、2199?bp（圖4），分別編碼715、691、711、733個氨基酸。

基于在線NABI數據庫的Conserved Domains分析（https：//www.ncbi.nlm.gov/cdd/）發現，4個SgPALs均屬于苯丙氨酸解氨酶家族（PLN02457）成員，均具有2個保守的脫氨作用位點，即苯丙氨酸/組氨酸氨裂解酶蛋白標簽。多序列比對分析表明，4個SgPAL包含PAL家族蛋白的保守活性位點：G-[STG]-[LIVM]-[STG]-[AC]-S-G-?[DH]-L-?x-P-L-[SA]-x（2）-[SAV]，其中內部三肽A-S-G是自催化環化和脫水形成4-甲基-5-咪唑基團（4-methyl diene-imidazol-5-one， MIO）的關鍵活性位點，而MIO可直接消除α-氨基。此外，將4個SgPALs基因的假定氨基酸序列與模式植物擬南芥、水稻以及驗證功能的大豆PALs構建系統進化樹，發現PALs蛋白可以分為2個類群即單子葉植物（水稻）和雙子葉植物（擬南芥、大豆、柱花草）（圖5），柱花草SgPAL1、SgPAL3、SgPAL4屬同小分枝，且SgPAL1與SgPAL4兩者序列相似性較高為87.18%，其中SgPAL1與大豆GmPAL-2.1（NP_001236956.2）相似性最高為87.59%，SgPAL3、SgPAL4與大豆GmPAL（Glyma03g 33880）相似性最高分別為84.66%、88.95%。同樣，SgPAL2與大豆GmPAL（Glyma03 g33880）氨基酸序列相似性最高為69.92%。

2.3 SgPALs基因的表達模式分析

2.3.1 炭疽菌對SgPALs表達的影響??如圖6所示，接種炭疽菌后，柱花草葉和莖中的SgPAL1、SgPAL2和SgPAL3的表達量與對照相比提高45.65%～1061.25%，差異顯著，但SgPAL4在葉中的表達顯著下調72.37%（圖6D）。

2.3.2??干旱對SgPALs表達的影響??由圖7可知，與對照相比，干旱脅迫顯著上調了4個SgPALs在根系中的表達，增加了88.11%～1024.63%;在莖中，僅SgPAL4受干旱脅迫誘導上調表達;在葉片中，SgPAL1和SgPAL4受干旱脅迫誘導上調表達。

2.3.3 ?鹽脅迫對SgPALs表達的影響??由圖8可知，在鹽脅迫下，柱花草4個SgPALs基因在根系中均顯著上調表達，增加了103%～479%;柱花草的SgPAL1、SgPAL2和SgPAL3在莖中受鹽脅迫誘導顯著上調表達，其中上調幅度最大的基因是SgPAL3，達3.63倍;在葉片中，SgPAL1、SgPAL2和SgPAL4受鹽脅迫誘導顯著上調表達。

3??討論

炭疽病是由炭疽菌侵染植物引起的真菌病害，嚴重抑制植物生長，包括山葵、辣椒、柱花草等^[20，26-28]。干旱和鹽害是典型的非生物脅迫逆境因素，在脅迫下植物體內活性氧過量累積，導致膜脂過氧化、細胞膜透性增強、細胞組分改變，嚴重制約植物的生長和產量^[5，17-18]。柱花草是重要的熱帶豆科牧草，起源于中南美洲及加勒比海地區，具有適應性強、耐酸瘦土壤、耐旱等優點，是研究植物抗生物脅迫（炭疽病）和非生物脅迫（干旱和鹽害）的理想材料^[17-18，20]。

黃酮類物質是苯丙烷代謝途徑的一大類下游產物，在植物體內具有多種功能，可作為生長發育的調節因子和信號分子，能清除紫外線，具有抗菌和抗氧化的功效等，廣泛響應環境對植物的刺激，其中研究較為透徹的是其作為抗氧化劑，吸收自由基、淬滅單線態氧、分解過氧化物，調節活性氧和自由基在植物體內的穩態平衡，降低植物的氧化損傷^[29]。PAL是連接初級代謝（莽草酸途徑）和次級代謝（苯丙烷途徑）的關鍵誘導酶，其活性和濃度控制著下游代謝產物的產生效率，進而影響植物的抗逆策略，研究發現大量逆境因素（如高溫、鹽害、紫外線等）均能提高PAL的酶活性，轉錄水平也發現大量PAL的同源基因顯著上調表達^[30]。本研究克隆了4個SgPALs基因（圖4），多序列比對分析發現它們均屬于苯丙氨酸解氨酶家族（PLN02457）成員。

研究發現植物在抵抗病原菌侵染時，主要由局部防御和系統防御2種措施，其中系統防御措施主要依靠在遠離感染部位的組織中大量合成抗菌復合物并轉運到受傷部位抑制微生物，包括多酚、木質素、異黃酮-植保素等^[2]。同時，類黃酮已被證明具有抗菌活性，能參與保護植物抵抗病原菌的侵染^[30]。如在芒果中，含花青素和類黃酮較高的紅色芒果具有更強的抗炭疽菌能力^[3]。Zhang等^[31]研究表明，西紅柿突變體Delia體內花青素累積，導致ROS減少，降低灰霉病的易感性。本研究也得到一致的結果，柱花草接種炭疽菌后，與對照相比，其葉片的PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量及總抗氧化能力均顯著提高，而莖的PAL酶活性和總抗氧化能力顯著增強，結果表明炭疽菌侵染柱花草葉片誘導總酚和類黃酮等苯丙烷代謝途徑的下游代謝物大量產生，以防御炭疽菌的侵害，而柱花草莖可能通過上調苯丙烷代謝途徑的其他代謝物提高抗氧化能力，以抗炭疽病。此外，本研究發現柱花草葉和莖均有3個基因顯著上調表達，其中SgPAL3在葉和莖中的上調幅度均最高（圖6）。進化樹分析發現SgPAL3與大豆GmPAL（Glyma03g33880）相似性最高，且Shine等^[32]研究發現GmPAL（Glyma03g33880）能調控水楊酸的累積，抵抗大豆疫霉病，因此推測SgPAL3可能具有影響柱花草抗炭疽病的功能。

正常條件下，植物體內ROS的生成和清除處動態平衡狀態，當植物遭遇干旱和鹽害等非生物脅迫時，穩態被破壞，導致ROS迅速累積，氧化損傷植物^[8]。而類黃酮代謝物具有較強的抗氧化活性，能清除ROS，保護植物。研究發現，干旱脅迫能誘導黃酮類累積，提高抗氧化能力，包括小茴香、擬南芥、葡萄等^[33]。同時，在植物的葉、根中，鹽脅迫能誘導多酚、類黃酮等抗氧化代謝物的累積，消除ROS，包括丹參、玉米、龍葵等^[34]。以上研究表明苯丙烷代謝途徑的類黃酮等酚類化合物對植物抗旱和抗鹽害起重要作用。同樣，本研究也發現，干旱脅迫下的柱花草葉、莖、根和鹽脅迫下柱花草的葉、根的PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量以及總抗氧化能力均顯著升高（圖2，圖3），但鹽脅迫下柱花草莖的總酚和總抗氧化能力無顯著變化（圖3）。RT-qPCR分析表明，干旱和鹽害脅迫下均有SgPALs基因不同程度地顯著上調，其中干旱脅迫下，SgAPL4在葉和莖中的上調幅度最大（圖7D），SgAPL2在根中的上調表達倍數達10.24（圖7B）。鹽脅迫下，柱花草葉、莖、根中顯著上調幅度最大的基因分別是SgPAL3、SgPAL3、SgPAL4。同時，進化分析表明SgPAL3、SgPAL4均與GmPAL（Glyma03g33880）相似性最高，而實驗也表明GmPAL（Glyma03g33880）能調控下游水楊酸代謝^[32]，因此推測SgPAL3、SgPAL4可能調控下游代謝物的合成，抵抗非生物脅迫。

綜上所述，本研究發現所檢測的不同組織和脅迫下，柱花草PAL酶活均顯著升高，除鹽脅迫和接種炭疽菌下柱花草莖以外，其余總抗氧化能力及貢獻抗氧化作用的總酚、類黃酮也均提高。表達模式分析結果顯示，生物脅迫（炭疽病）和非生物脅迫（干旱和鹽害）下，柱花草均有SgPALs基因不同程度地顯著上調。結果表明，接種炭疽菌（葉）、干旱（葉、莖、根）和鹽害（葉、根）下的大部分柱花草組織以提高SgPAL的表達和PAL的活性，促進下游總酚和類黃酮的代謝，以提高總抗氧化能力響應生物和非生物脅迫。

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