沙眼衣原體通過誘導IL-10抑制炎癥因子產生①

杜 昆 曹昌柏

(湖北省荊州市第一人民醫院輸血科，荊州434000)

病原微生物入侵機體后，機體免疫細胞可產生多種促炎癥細胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，并引起機體的炎癥反應，其結果不利于病原體的存活[1]。然而，某些病原體能通過誘導機體免疫細胞產生抗炎癥細胞因子而抑制機體的免疫反應，如IL-10，從而導致病原體在機體內長期存活[2,3]。IL-10主要通過JAK/STAT(Janus Kinase/signal transducer and activator of transcription)信號通路發揮作用，首先IL-10與其受體IL-10 R1結合并激活JAK1與TyK2，激活的JAK1磷酸化IL-10 R1的兩個酪氨酸殘基Y446 與Y449，磷酸化的兩個酪氨酸殘基即成為STAT3的錨定位點，轉錄因子STAT3通過其SH2區域與這些部位相結合并被激活，然后STAT3形成二聚體轉入細胞核內結合到啟動子相關的STAT結合元件上選擇性地抑制或啟動基因的轉錄。

有文獻報道某些病原微生物能通過激活機體的某些信號通路誘導IL-10的表達[2-4]。而沙眼衣原體作為一種嚴格細胞內寄生的病原體，其整個生活周期都依賴于宿主細胞，并對宿主的多條信號通路產生影響[5-8]。 衣原體感染人外周血單個核細胞后能誘導IL-10的產生[9,10]；此外，Yilma等[11]報道外源性IL-10能抑制沙眼衣原體感染細胞促炎癥細胞因子的產生，但其機制如何以及衣原體感染誘導的內源性IL-10是否有相同的作用尚不知曉。本課題旨在探討內源性IL-10對衣原體感染人外周血單個核細胞促炎癥細胞因子產生的影響及其機制，為防治衣原體感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640細胞培養基購自Invitrogen公司，小牛血清購自杭州四季青公司，抗人IL-10抗體購自R&D公司，人IL-10、IL-6和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，化學抑制劑Ruxolitinib購自博歐特生物科技有限公司，ECL發光試劑盒購自Pierce公司。

1.2方法

1.2.1沙眼衣原體增殖 將 HeLa229 細胞接種到50 cm2細胞培養瓶中，細胞長成單層 75%融合后，棄培養基，加沙眼衣原體L2懸液，2 h 后棄上清，更換衣原體生長液(含10%胎牛血清和2 mg/L放線菌酮)，48 h后收集細胞并重懸細胞沉淀，37℃水浴與-80℃反復凍融3次，1 000 r/min離心8 min，上清即為衣原體懸液，分裝后-80℃保存備用。

1.2.2外周血單個核細胞的制備和沙眼衣原體的感染 抽取健康志愿者外周血10 ml注入50 ml離心管中，加入10 ml PBS并輕輕混勻；取15 ml 離心管兩支，加入Ficoll溶液5 ml，再將10 ml稀釋的血液輕輕加入兩支15 ml離心管中，2 000 r/min，20 min；用吸管將白色細胞層吸取到另一15 ml離心管中，加入PBS至10 ml，1 500 r/min，10 min，去掉上清，反復操作3次；加入5 ml含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養基重懸細胞，進行細胞計數并接種到96孔板中，每孔5×104個細胞，加入3 MOI或如實驗所示不同滴度的沙眼衣原體懸液作為感染組，同時設立未感染衣原體組作為對照組，37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.3ELISA雙抗體夾心法檢測細胞因子 取細胞培養液上清到無菌試管中，3 000 r/min，10 min，除去細胞碎片和雜質，取上清，-20℃保存，待所有標本收齊后用ELISA雙抗體夾心法檢測上清細胞因子IL-10、IL-6和TNF-α含量。具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4Western blot實驗 提取細胞總蛋白，取100 μg 蛋白樣品加入到等體積的2×SDS樣品緩沖液中，于沸水中加熱5 min，冷卻后立即加樣；4℃、120 V電壓電泳4 h左右；電泳結束后，將蛋白條帶轉移至PVDF(Polyvinylidene fluoride)膜中，4℃、80 V 轉移2 h；轉膜完成后，取出PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入特異性的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，每遍10 min；加入HRP標記的二抗IgG，室溫孵育1 h，然后TBST洗膜3遍，每遍10 min，TBS洗膜3遍，10 min，最后用ECL發光試劑盒發光顯影。

2 結果

2.1沙眼衣原體誘導外周血單個核細胞IL-10產生 如圖1A所示，外周血單個核細胞在沙眼衣原體感染下，IL-10分泌增加，且隨沙眼衣原體感染滴度的增加，產生IL-10的量也逐漸增多。圖1B所示，3 MOI衣原體感染后8 h IL-10的產生量明顯增加，且隨著感染時間的延長，產生IL-10的量也逐漸增多，在48 h達到頂峰，然后下降。不同滴度的衣原體感染組和3 MOI感染8 h后各時間點的IL-10產生量與對照組比較差異均有統計學意義(t=8.342、9.631，均P<0.05)。

2.2內源性IL-10對IL-6和TNF-α分泌影響 如圖2所示，在沙眼衣原體的作用下，外周血單個核細胞IL-6和TNF-α產生量均增多，但當加入抗人IL-10抗體時，細胞IL-6和TNF-α產生量明顯增多，與沙眼衣原體感染但未加抗人IL-10抗體組比較，IL-6和TNF-α的表達差異均有統計學意義(t=10.326、11.231，均P<0.05)。

圖1 沙眼衣原體誘導外周血單個核細胞IL-10分泌Fig.1 Chlamydia trachomatis induces IL-10 secretion in peripheral blood mononuclear cellsNote: *.P<0.05.

圖2 抗IL-10抗體上調沙眼衣原體感染細胞IL-6和TNF-α分泌Fig.2 Anti IL-10 antibody increases IL-6 and TNF-α secretion in Chlamydia trachomatis infected cellsNote: *.P<0.05.

圖3 抗IL-10抗體抑制沙眼衣原體感染細胞STAT3蛋白磷酸化Fig.3 Anti IL-10 antibody inhibits STAT3 protein phosphorylation in Chlamydia trachomatis infect-ed cells

圖4 抑制STAT3蛋白磷酸化導致IL-6和TNF-α分泌增多Fig.4 Inhibition of phosphorylated STAT3 expression increases production of IL-6 and TNF-αNote: *.P<0.05.

2.3內源性IL-10對STAT3蛋白活性影響 如圖3A所示，外周血單個核細胞在沙眼衣原體感染下，STAT3蛋白發生磷酸化，且隨沙眼衣原體感染滴度的增加，磷酸化的STAT3蛋白也逐漸增多，呈劑量依賴性。圖3B所示，當感染細胞中加入抗人IL-10抗體時，磷酸化的STAT3蛋白明顯減少。

2.4STAT3蛋白對IL-6和TNF-α產生影響 如圖4A所示，1 μmol/L化學抑制劑Ruxolitinib能明顯抑制沙眼衣原體感染細胞STAT3蛋白的磷酸化。在1 μmol/L化學抑制劑Ruxolitinib作用下，沙眼衣原體感染的外周血單個核細胞產生的IL-6和TNF-α明顯增多，與沙眼衣原體感染的未加抑制劑處理的細胞組相比，IL-6和TNF-α的表達差異均有統計學意義(t=12.301，P<0.05，圖4B)。

3 討論

抗炎癥細胞因子IL-10在病原體入侵時對機體的免疫應答起到重要的調節作用[12]。以往的研究證實衣原體能誘導單核-巨噬細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞等產生IL-10[13-16]。此外，IL-10能通過抑制促炎癥細胞因子的產生而抑制機體的免疫功能，從而有利于衣原體在機體內存活[17]。這些結果表明，衣原體能通過誘導IL-10的表達而抑制促炎癥細胞因子的產生，從而降低機體的免疫反應，有利于衣原體在機體內長期存活。然而，衣原體誘導產生的內源性IL-10抑制炎癥細胞因子產生的機制尚不清楚。

本研究表明，外周血單個核細胞在沙眼衣原體感染后8 h，IL-10分泌明顯增加，在48 h達到頂峰，然后下降；此外，隨著感染滴度的增加，產生的IL-10也逐漸增多，呈劑量依賴性。有研究表明外源性IL-10能抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的產生[11]，但內源性IL-10是否有相同的功能尚不知曉。本研究表明，沙眼衣原體感染的外周血單個核細胞產生較多的IL-6和TNF-α，但當加入抗人IL-10抗體時，細胞IL-6和TNF-α分泌量明顯增多，表明沙眼衣原體誘導產生的內源性IL-10也有抑制炎癥因子產生的功能。由于IL-10主要通過活化STAT3蛋白發揮作用，為證實STAT3蛋白是否參與IL-10抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產生，我們首先檢測IL-10是否活化STAT3蛋白。結果表明，外周血單個核細胞在沙眼衣原體感染下，STAT3蛋白發生磷酸化，且隨著感染滴度的增加，磷酸化的STAT3蛋白也逐漸增多。但當感染細胞中加入抗人IL-10抗體時，磷酸化的STAT3蛋白明顯減少，表明沙眼衣原體是通過誘導IL-10表達而活化STAT3蛋白。為進一步證實IL-10抑制炎癥因子產生的功能是否與其活化STAT3蛋白有關，我們用化學抑制劑Ruxolitinib抑制沙眼衣原體感染細胞STAT3蛋白的磷酸化。結果表明，在化學抑制劑Ruxolitinib作用下，沙眼衣原體感染的外周血單個核細胞分泌的IL-6和TNF-α明顯增多，提示IL-10可能通過活化STAT3蛋白抑制炎癥因子的產生。

有文獻報道，剔除IL-10基因的小鼠感染衣原體后會發生較強的炎癥反應而損害機體組織[18]，缺乏IL-10基因的細胞也不利于沙眼衣原體的存活[19]。本研究結果提示沙眼衣原體通過誘導IL-10活化STAT3蛋白從而抑制炎癥因子的產生，一方面可以降低機體的炎癥反應程度，另一方面也不利于衣原體的清除，這可能是衣原體在宿主細胞中長期存活的策略之一。