巨細胞病毒感染與自然流產及免疫細胞因子水平的關聯性分析

周榮生 柯 旭

(合肥市第三人民醫院婦產科，合肥230022)

人巨細胞病毒(Human cytomegalorirus,HCMV)是目前最為常見的造成孕婦及胎兒宮內感染的病毒，HCMV感染造成的危害較大，孕婦如在孕早期發現HCMV感染，則可能通過胎盤或產道感染胚胎，導致流產、早產、死胎、畸胎、新生兒發育遲緩、新生兒先天缺陷等等[1-3]。除巨細胞病毒以外，風疹病毒、弓形體、單純皰疹病毒也是導致孕婦發生宮內感染的主要因素，但研究表明HCMV對胎兒造成的傷害比風疹病毒更嚴重[4,5]。因此，臨床中HCMV感染已引起廣泛重視，需要對孕婦的HCMV感染情況進行及時檢測。文獻報道，HCMV感染后會引發機體的免疫應答，而相關的細胞因子則是免疫應答中的關鍵調節者，對細胞因子的檢測往往可以對感染性疾病進行有效評估，其中IL-1、IL-6和IFN是感染性疾病中較為重要的免疫相關因子[6，7]。為了探究HCMV感染與自然流產及免疫反應的關聯性，我們采用PCR反應對稽留流產和正常妊娠孕婦的HCMV-DNA進行檢測與對比，并對比HCMV感染孕婦與非感染孕婦血清中IL-1、IL-6和IFN的表達，現報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 研究對象為我院收治的稽留流產孕婦89例和同期正常妊娠孕婦63例，其中稽留流產孕婦均符合第6版《婦產科學》中自然流產的診斷標準[8]。稽留流產組孕婦年齡為17～43歲，平均年齡(27.88±14.89)歲，妊娠時間為45～106 d，平均(76.23±29.77)d；正常妊娠組孕婦年齡為17～43歲，平均年齡(27.90±15.10)歲，妊娠時間為42～107 d，平均(75.32±31.68)d。兩組的年齡與妊娠時間經比較無明顯差異，具有可比性。

納入標準：①稽留流產孕婦經臨床各項檢查，均符合第6版《婦產科學》中自然流產的診斷標準[8]；②孕婦生殖內分泌功能正常、無家族遺傳性疾病、生殖器解剖功能正常；③孕婦及家屬了解并配合本研究進行，自愿簽署知情同意書。

排除標準：①合并有惡性腫瘤的孕婦；②孕婦因染色體異常、解剖結構異常、內分泌異常等因素造成流產；③孕婦因妊娠期服用有害藥物導致流產；④孕婦患有精神疾病無法配合研究進行。

1.2方法 收集所有孕婦的外周血4 ml，平均置于2管中。一管用于HCMV-DNA的水平檢測，另一管用于檢測血清中免疫相關因子IL-1、IL-6、IFN的水平。檢測HCMV-DNA水平，首先于外周血中加入溶血試劑，將紅細胞破壞后經過蛋白酶消化，采用DNA酚氯仿抽提法提取孕婦的外周血DNA，隨后應用聚合酶鏈式反應檢測HCMV-DNA水平，全過程均按照PCR試劑盒說明書進行操作，PCR試劑盒購自TaKaRa公司。檢測血清中炎性因子水平，采用ELISA檢測血清IL-1、IL-6、IFN的表達水平，操作完全按照試劑盒的說明書進行，本研究所采用IL-1、IL-6、IFN的ELISA檢測試劑盒均購自美國Genzyme公司。

2 結果

2.1稽留流產孕婦與正常妊娠孕婦HCMV感染情況比較 89例稽留流產孕婦中檢查出29例HCMV感染陽性，陽性率32.58%，明顯高于正常妊娠的孕婦63例(9.52%)，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2感染組與非感染組孕婦血清免疫相關因子IL-1、IL-6和IFN的表達水平比較 結果如表1所示，HCMV感染組患者的血清IFN、IL-1和IL-6水平均明顯高于非感染組，兩組間差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3血清免疫相關因子IL-1、IL-6和IFN的表達水平與HCMV感染的Logistic回歸分析 根據表2可知，分別針對兩組孕婦的血清免疫相關因子IL-1、IL-6和IFN的表達水平與HCMV感染的Logistic回歸分析，結果顯示血清IFN、IL-1、IL-6的最大似然估計值和OR值均>0，則說明血清IFN、IL-1、IL-6水平與HCMV感染存在正相關，孕婦血清中的IFN、IL-1、IL-6表達水平越高，孕婦發生HCMV感染的概率越高。

2.4流產蛻膜絨毛組織鏡檢病理圖示例 HCMV感染表達陽性的流產蛻膜絨毛組織鏡檢病理圖示例如下：其中圖1A組織取自蛻膜組織，可見組織中腺體呈高度分泌反應，部分腺體呈A-S樣改變；圖1B組織取自蛻膜組織，可見間質有中性粒細胞浸潤；圖2A組織取自絨毛組織，如圖所示絨毛組織體積小，間質輕度水腫，周圍滋養層細胞結節樣增生；圖2B組織取自絨毛組織，間質輕度水腫，周圍滋養層細胞萎縮。圖2C取自普通流產絨毛組織，鏡下絨毛間質無出血及炎細胞浸潤。

ItemInfectedgroup(n=35)Non-infectedgroup(n=117)tPIFN-α(ng/L)1.17±0.230.84±0.179.243 10.000 0IL-1(ng/L)35.42±15.246.78±2.7619.225 40.000 0IL-6(ng/L)156.38±33.9233.52±7.8836.288 30.000 0

表2 血清免疫相關因子IL-1、IL-6和IFN的表達水平與HCMV感染的Logistic回歸分析

Tab.2 Logistic regression analysis of serum immune related factors IL-1,IL-6 and IFN expression levels and HCMV infection

ItembSE(b)Wald χ2ORPIFN1.9210.917.3622.2610.003 4IL-11.9580.897.1972.1320.001 9IL-62.0030.907.2262.1760.002 3

圖1 蛻膜組織鏡檢病理圖示Fig.1 Mortar tissue microscopy pathologyNote: A.Specimen is taken from the decidual tissue.The gland is highly secreted and some glands are A-S-like (HE staining,×10);B.Specimen is taken from decidual tissue interstitial neutrophil infiltration (HE staining,×40).

圖2 絨毛組織鏡檢病理圖示Fig.2 Villus tissue pathologyNote: A.Specimen is taken from villus tissue. Small volume of fluff tissue, interstitial mild edema, nodular cell hypertrophy (HE staining,×100);B.Specimen is taken from villus tissue. Mild interstitial edema, atrophy of surrounding trophoblast cells (HE staining,×200);C.Specimen is taken from normal villus tissue.No bleeding and inflammatory cell infiltration in the villus interstitial (HE staining,×20).

3 討論

巨細胞病毒廣泛存在于自然界中，種屬特異性嚴格，其中能導致人類發病的巨細胞病毒稱為人巨細胞病毒[1]。HCMV是一種B皰疹病毒，它的體積較大，長度約為240 kb，分子量約為150 kD[9]。研究報道HCMV是造成宮內胎兒感染的主要病原體，孕婦在妊娠的各時期感染HCMV均可以造成流產、早產、畸胎、死胎等不良的妊娠結局[10]。我國孕婦感染HCMV的陽性率近年來呈逐年增高的趨勢，由于HCMV的感染往往為潛伏感染，大多孕婦感染后無臨床癥狀，成為長時間攜帶病毒體[11]。因此，對孕婦的HCMV感染進行早期診斷具有重要的臨床意義。目前，對HCMV感染進行診斷主要有以下幾個方面，包括外周血、體液、分泌物等標本中進行病毒的分離培養，以及外周血HCMV-DNA的PCR檢測，其中外周血HCMV-DNA的陽性表達被認為是早期診斷巨細胞病毒感染的有效指標[12]。

與風疹病毒、單純皰疹病毒等病毒一樣，一旦發生感染，HCMV會在宿主體內建立長期的潛伏，但如在正常人體內腺體潛伏，該感染并不危害人體健康，但對免疫低下個體如胎兒、艾滋病患者等均可造成嚴重損害，甚至威脅生命[13]。妊娠早期孕婦體內的激素水平會發生一系列改變，導致孕婦的免疫力降低，因此會增加其對HCMV感染等不良影響的敏感性[13]。有研究稱孕婦若感染HCMV，HCMV將會播散至孕婦全身各臟器，進而通過胎盤傷害到胎兒，造成稽留流產或死胎等不良結局[13]。本研究中稽留流產孕婦的HCMV感染陽性率(14.52%)明顯高于正常妊娠的孕婦(5.88%)支持了上述觀點。目前，對于HCMV病毒感染所導致的自然流產、死胎、畸胎等不良妊娠結局尚無有效的治療方案，臨床中大多采用抗病毒感染藥物如更昔洛韋，但會對孕婦造成一定的毒副作用，傳統的減毒疫苗又因存在致癌性而無法在臨床廣泛應用[14，15]。因此，對孕婦加強妊娠期監測和早期診斷是尤為必要的，對有無HCMV感染進行及時檢測，避免孕婦盲目保胎而發生自然流產，具有重要的臨床意義。

Th細胞是一類均陽性表達CD4的T細胞，即CD4+T細胞。Th細胞又分為Th1和Th2細胞，Th1細胞主要分泌IL-2細胞因子發揮細胞免疫功能，促進T細胞的增殖與分化[15]。Th2細胞主要功能為刺激B細胞增殖并產生IgG1和IgE抗體，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10等細胞因子調節體液免疫，上述因子的表達異常與體液免疫的異常密切相關[15]。而研究發現，CMV感染主要是通過引發減低Th1細胞免疫功能，從而抑制機體免疫調節。臨床檢測結果顯示CMV-IgM陽性患者的血清中IL-2因子水平較正常孕婦顯著降低，說明患者的免疫功能受到抑制，進而導致一些具有抗CMV功能的淋巴因子減少[15]。IFN是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子，是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。其主要是通過細胞產生的抗病毒蛋白抑制病毒復制，而并不直接殺傷病毒，除此之外 IFN還可增強NK細胞、巨噬細胞和T細胞的活力，并起到免疫調節作用，從而增強抗病毒能力，故本研究中HCMV感染組患者的血清IFN高達(1.17±0.23)ng/L，高于正常妊娠組的孕婦。

IL是多種細胞產生能作用于多種細胞的一類細胞因子，其中IL-1主要由活化的單核巨噬細胞產生，主要生物學功能是協同刺激T細胞活化，促進B細胞增殖和分泌抗體；IL-6主要由單核巨噬細胞、Th2細胞等細胞產生，能夠作用于巨噬細胞、活化的B細胞及漿細胞等多種靶細胞，IL-6具有刺激B細胞增殖、增加抗體生成、刺激T細胞增殖、增強IL-1的致有絲分裂作用等生物學功能。而CMV感染主要是影響Th1細胞的免疫功能，能夠抑制Th1細胞產生IL-2的產生，但是對IL-6及IL-1的產生影響甚微。故HCMV感染組患者的血清IL-1和IL-6水平均明顯高于非感染組。

本研究中，針對兩組孕婦的血清炎癥因子IL-1和IL-6的表達水平與HCMV感染的Logistic回歸分析，結果顯示血清IFN、IL-1、IL-6的最大似然估計值和OR值均>0，則說明血清IFN、IL-1、IL-6水平與HCMV感染存在正相關，孕婦血清中的IFN、IL-1、IL-6表達水平越高，孕婦發生HCMV感染的概率越高，同時因為HCMV感染會增加流產概率，故本研究猜測IFN、IL-1及IL-6水平與致流產存在相關性。但是，本研究未得到IFN、IL-1及IL-6提示流產發生的危機值，這也為下一步研究提供了新方向。

綜上所述，孕婦發生HCMV感染可以增加胚胎感染的風險，進而導致自然流產的發生，而IL-1、IL-6和IFN等免疫反應因子與HCMV感染的病理過程密切相關，可以作為孕婦HCMV感染的輔助血清檢測指標。