參附注射液通過調控自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用研究①

賈合磊 盧長青 王 娟 任冬冬 陳亞奇

(河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院急診科，鄭州450002)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemic reperfusion in jury,MIRI)指冠狀動脈急性阻塞后短時間內心肌供血中斷，當心肌缺血恢復血流供應后，造成組織結構損傷加重的現象[1]。MIRI是臨床常見的心臟疾病，常見于冠狀動脈血管形成術、冠狀動脈重建術、心臟移植手術等術后并發癥[2]，對術后療效產生了嚴重的影響。MIRI的發病機制復雜，尚需更深入的研究，目前已知氧自由基累積造成過氧化損傷、中性粒細胞浸潤、鈣超載觸發線粒體功能障礙及鈣泵障礙、細胞程序性死亡均與MIRI有著重要聯系[3]。作為程序性死亡的一種，自噬在MIRI的起始和進展中發揮著重要作用[4]。參附注射液(Shenfu injection，SFI)是中國傳統中藥紅參與附子的提取物，主要活性成分是人參皂苷和烏頭類生物堿，具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂質過氧化、抗細胞內Ca2+超載等多種藥理作用[5]，常被用于心臟相關的疾病治療中。許多研究表明，SFI對MIRI具有顯著的療效[6]，而參附注射液對MIRI的精確分子機制仍有很多不清楚的地方。已有相關文獻報道參附能夠通過調節自噬減輕大鼠缺氧復氧心肌細胞損傷[7]，提示SFI可能通過調控自噬對MIRI起治療作用。為了進一步驗證這一結論，我們通過構建動物疾病模型和細胞模型，從體內體外兩個方向研究SFI對自噬的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 參附注射液購自雅安三九藥業有限公司，規格100 ml/支，批號：國藥準字Z20043116。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。胰蛋白酶購自美國Amersco公司。烏拉坦購自Sigma-aldrich公司。5-BrdU購自美國Selleck公司。HE染色試劑盒、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、血清乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IL-6、 IL-1β、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自上海酶聯生物。雷帕霉素(Rapamycin)購自美國Cayman chemical公司。MTT試劑盒、RIPA裂解液、ECL顯色液購自北京索萊寶生物公司。BCA試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldeh-yde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubulerassociated protein 1 light chain 3，LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、Beclin1、p62、磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)、p-PI3K、p-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR抗體購自Abcam公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2動物、分組和模型制備 40只(體質量 200～250 g)健康雄性大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2018-0004。于恒溫恒濕、明暗交替(12 h)的環境喂養48 h。40只大鼠隨機分為5組，每組8只。正常對照組、心肌缺血再灌注(Myocardial ischemic reperfusion，I/R)組、SFI 5、10和20 mg/kg組，除正常對照組外，其余組大鼠參照鄭曙云等[8]的研究，采用結扎冠狀動脈前降支復制I/R模型。大鼠用20%烏拉坦(1.0 g/kg)腹腔麻醉后，氣管插管，行人工控制呼吸。左側第四肋間開胸手術，剪開心包，暴露心肌，用圓形無創縫合針穿一段6/0絲線，置于左冠狀動脈前降支起始段下2 mm處。穩定10 min后，除正常對照組外，其余組結扎冠狀動脈前降支，以EKGII導聯1ST段明顯太高(≥0.1 mV)或T波高聳，心肌變暗紅色為結扎成功標志。結扎50 min后，按照分組，分別給予生理鹽水(I/R組)1 ml/100 g；或給予SFI 5、10和20 mg/kg。結扎60 min后，松開結扎線再灌注4 h[6,8]。

1.2方法

1.2.1CK、cTnⅠ、LDH檢測 靜脈采血后靜置10 min，待血液凝固后3 000 r/min離心15 min，取血清。按照試劑盒操作說明檢測CK、cTnⅠ、LDH。

1.2.2大鼠心肌梗死百分比檢測 取出心臟，用4℃生理鹽水清洗3次后稱重，將心肌沿著結扎線切成5份，0.125%NBT常溫染色15 min，非梗死區被染成藍色，梗死區灰白色。將梗死區心肌剪下稱重，以梗死區心肌重量占全心肌重量的百分比來表示心肌梗死百分比。

1.2.3HE檢測心肌組織病理變化 將心肌置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4IL-6、IL-1β和TNF-α檢測 IL-6、IL-1β、TNF-α的檢測通過酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒完成。

1.2.5細胞培養、細胞分組和心肌細胞缺糖缺氧復糖復氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型制備 參照Wang等[9]的實驗方法，心室肌細胞取自剛出生1～2 d大鼠心臟，組織使用PBS清洗3～4次，切碎并使用0.08%胰蛋白酶37℃處理8 min。之后加入新的0.08%胰蛋白酶溶液重復該步驟，直至組織完全消化后終止消化。差速貼壁90 min分離細胞，收集未貼壁細胞于含有10%FBS，100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基中5%CO2、37℃培養48 h，并加入0.1 mmol/L 5-BrdU抑制非心肌細胞增殖。將細胞隨機分為Control組、OGD/R組、SFI(25 μl/ml)組、SFI(50 μl/ml)組、SFI(100 μl/ml)組，除Control組常規培養以外，其余各組缺氧前將培養液換成無糖無血清培養液，SFI(25 μl/ml)組、SFI(50 μl/ml)組、SFI(100 μl/ml)組分別加入25 μl/ml、50 μl/ml、100 μl/ml的SFI預處理。之后培養于95%N2，5%CO2的37℃培養盒中4 h，造成缺糖缺氧損傷。之后將培養液換成正常DMEM培養液，在5%CO237℃培養箱中繼續培養24 h形成復氧復糖環境。

1.2.6雷帕霉素處理細胞 將SFI(100 μl/ml)組分為SFI(100 μl/ml)組、SFI+Rapamycin組，其中SFI(100 μl/ml)組按照1.2.5所述方法處理，SFI+Rapamycin組加入終濃度20 nmol/L的雷帕霉素孵育1 h后，再按照1.2.5所述方法處理。

1.2.7MTT檢測細胞活性 將細胞接種于96孔板中，按1.2.5、1.2.6所描述的方法對細胞進行分組及處理24 h后，每孔加入100 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，混勻后于培養箱中繼續培養4 h。4 h后每孔加入150 μl的二甲基亞砜，于搖床上低速振蕩10 min后，酶聯免疫檢測儀490 nm檢測細胞吸光度。

1.2.8試劑盒檢測心肌組織和細胞MDA和SOD水平 按照試劑盒操作說明檢測MDA和 SOD，其中心肌組織按如下方式預處理：取缺血區心肌組織200 mg，4℃生理鹽水清洗，碾碎制成10%心肌組織勻漿。

1.2.9Western blot檢測心肌組織和細胞蛋白表達 按照1.1.2、1.2.3、1.2.7中描述的方法對細胞或組織分組處理后(組織樣品需要進一步通過液氮搗碎處理)，用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒對各組細胞總蛋白濃度進行檢測后，將各組蛋白濃度調整至一致。每組各取30 μg蛋白用10%SDS-PAGE分離各組蛋白，將分離后的蛋白采用半干轉膜法轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入適宜濃度一抗，4℃孵育過夜。第2天用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)清洗3次后，加入二抗室溫孵育2 h后，滴加ECL顯色液曝光顯影。以GAPDH為內參。

總之，微課是對傳統教學模式的創新，在傳統的教學中起到了很好的輔助作用，有利于提高學生學習化學的興趣，有利于提高課堂的教學效率，有利于節省課堂教學時間，有利于培養學生的自主學習意識和能力.但是也必須認識到課堂教學必須以教師的講解為主，在適當的時候進行穿插運用，對教學起到輔助作用.

2 結果

2.1參附注射液對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷及氧化應激的影響 如表1所示，與Control組比較，I/R組中心肌損傷標記物CK、cTnⅠ、LDH表達量顯著升高(P<0.01)，氧化應激標記物MDA濃度顯著升高，SOD活性顯著降低(P<0.01)，心肌梗死面積顯著增加(P<0.01)，差異有統計學意義；與I/R組比較，SFI組的心肌損傷標記物CK、cTnⅠ、LDH表達量隨著SFI濃度的提高而降低，但不存在顯著差異；SFI(10、20 mg/kg)組的心肌損傷標記物CK、cTnⅠ、LDH表達量隨著SFI濃度的提高而降低(P<0.01)；SFI(5、10、20 mg/kg)組氧化應激標記物SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且呈濃度依賴性變化；心肌梗死面積隨著SFI濃度的提高而降低(P<0.05,P<0.01)，差異有統計學意義。

2.2參附注射液對心肌缺血再灌小鼠心肌組織病理變化的影響 如圖1所示，Control組心肌纖維整齊，心肌細胞無嗜酸性變、纖維結構改變；I/R組心肌細胞嗜酸性變，纖維結構改變，出現收縮帶，肌絲溶解，空泡變性；SFI(5、10、20 mg/kg)組中也出現了嗜酸性變、纖維結構改變的情況，但是病理變化隨加入的SFI濃度升高逐步減輕。

2.3參附注射液對心肌缺血再灌小鼠心肌炎癥因子水平的影響 如表2所示，與Control組比較，I/R組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β濃度顯著升高差異有統計學意義(P<0.01)；與I/R組比較，SFI(5、10、20 mg/kg)組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且TNF-α、IL-6、IL-1β濃度同SFI濃度呈負相關，差異有統計學意義。

2.4SFI抑制大鼠心肌自噬 如圖2所示，與Control組比較，I/R組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達水平顯著增高(P<0.01)，p62表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與I/R組比較，SFI(5 mg/kg)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1表達水平降低，p62表達水平升高，但變化不存在顯著差異；SFI(10、20 mg/kg)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1表達水平降低(P<0.01)，與SFI濃度變化呈負相關，p62表達水平增高(P<0.01)，與SFI濃度變化呈正相關，差異有統計學意義。

表1 SFI對大鼠心肌組織損傷標記物及氧化應激標記物表達及心肌梗死面積比率的影響

Tab.1 Effect of SFI on expression of myocardial tissue injury and oxidative stress markers and myocardial infarct size in rats

GroupsnCK(U/L)cTnⅠ(ng/L)LDH(U/L)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)Mean myocardialinfarction area(%)Control81 623.06±152.3028.32±2.36853.90±103.48223.54±19.865.63±0.826.95±0.83I/R84 072.20±261.5169.21±5.642 018.00±165.8092.36±10.5318.92±1.6548.76±3.21SFI(5 mg/kg)83 654.40±287.1061.35±5.861 753.01±153.82112.58±15.6216.21±1.0840.56±3.08SFI(10 mg/kg)82 872.82±235.6349.24±5.231 385.78±102.56162.54±14.5312.58±1.2325.32±3.12SFI(20 mg/kg)81 986.01±213.8037.89±4.841 072.00±95.63198.63±22.557.62±0.9616.54±2.56

圖1 HE染色檢測SFI對大鼠心肌組織病理變化的影響(×400)Fig.1 Effect of SFI on pathological changes of rat myocardium was detected by HE staining(×400)

2.5SFI提高大鼠心肌組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性 如圖3所示，與Control組比較，I/R組p-PI3K/PI3K表達量比率顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達量比率降低，但不存在顯著差異；與I/R組比較，SFI(5、10、20 mg/kg)組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達量比率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，與SFI濃度呈正相關，差異有統計學意義。

表2 SFI對大鼠心肌組織TNF-α，IL-6，IL-1β水平影響

Tab.2 Effects of SFI on concentration of TNF-α,IL-6 and IL-1β in rat myocardial tissue

GroupnTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-1β(pg/ml)Control848.36±7.3538.62±4.8950.89±8.65I/R8125.23±9.5683.39±6.35135.65±9.56SFI(5 mg/kg)8106.22±8.9666.32±6.23102.35±12.35SFI(10 mg/kg)874.54±8.5648.36±5.6881.98±11.23SFI(20 mg/kg)861.36±9.2342.38±6.1265.23±8.68

圖2 SFI對大鼠心肌組織LC3、Beclin1、p62表達影響Fig.2 Effect of SFI on expression of LC3,Beclin1 and p62 in rat myocardial tissueNote: n=8,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus I/R group.

圖3 SFI對大鼠心肌組織PI3K、Akt、mTOR表達影響Fig.3 Effect of SFI on expression of PI3K,Akt,mTOR in rat myocardial tissueNote: n=8,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus I/R group.

2.6SFI提高大鼠心肌OGD/R細胞活性 如圖4所示，與Control組比較，OGD/R組細胞活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與OGD/R組比較，SFI(25 μl/ml)組細胞活性提高，但不具有顯著差異；SFI(50、100 μl/ml)組細胞活性顯著提高(P<0.05,P<0.01)，與SFI濃度呈正相關，差異有統計學意義。

2.7SFI對心肌細胞中SOD和MDA的影響 如表3所示，與Control組比較，OGD/R組SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統計學意義；與OGD/R組比較，SFI(25、50、100 μl/ml)組SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，與SFI濃度呈正相關，差異有統計學意義；SFI(25 μl/ml)組MDA濃度降低，但不具有顯著差異；SFI(50、100 μl/ml)組MDA濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，與SFI濃度呈負相關，差異有統計學意義。

圖4 SFI對OGD/R細胞活性影響Fig.4 Effect of SFI on OGD/R cell viabilityNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus OGD/R group.

表3 SFI對OGD/R細胞SOD活性及MDA濃度的影響

Tab.3 Effect of SFI on SOD activity and MDA concentr-ation in OGD/R cell

GroupnSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)Control625.33±1.824.17±0.32OGD/R66.78±1.207.31±0.56SFI(25 μl/ml)612.60±1.606.50±0.63SFI(50 μl/ml)616.71±1.545.22±0.58SFI(100 μl/ml)621.20±2.294.55±0.42

圖5 SFI對OGD/R細胞LC3、Beclin1、p62表達影響Fig.5 Effect of SFI on expression of LC3,Beclin1 and p62 in OGD/R cellNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus OGD/R group.

圖6 雷帕霉素對SFI調控自噬的影響Fig.6 Effect of rapamycin on ability of SFI to regul-ate autophagyNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；##.P<0.01 versus OGD/R group；&&.P<0.01 versus SFI(100 μl/ml) group.

2.8SFI抑制受損心肌細胞自噬 如圖5所示，與Control組比較，OGD/R組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達水平顯著升高(P<0.01)，p62表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與OGD/R組比較，SFI(25、50、100 μl/ml)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)，與SFI濃度呈負相關，p62表達水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)，與SFI濃度呈正相關，差異有統計學意義；SFI(25 μl/ml)組Beclin1表達水平降低，但不具有顯著差異；SFI(50、100 μl/ml)組Beclin1表達水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)，差異有統計學意義。

圖7 雷帕霉素對SFI保護細胞活性的影響Fig.7 Effect of rapamycin on ability of SFI to protect cell viabilityNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；##.P<0.01 versus OGD/R group；&&.P<0.01 versus SFI(100 μl/ml) group.

2.10雷帕霉素拮抗SFI對細胞活性的保護作用 如圖7所示，與Control比較，OGD/R組的細胞活性顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與OGD/R組比較，SFI(100 μl/ml)組、SFI+Rapamycin組的細胞活性顯著升高(P<0.01)，差異有統計學意義；與SFI(100 μl/ml)組比較，SFI+Rapamycin組細胞活性顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義。

3 討論

自噬是廣泛存在于真核生物中的一種維持細胞自身穩態的調控機制，是細胞通過形成自噬體并進一步與溶酶體結合降解自身受損的細胞器和蛋白質的過程，對細胞具有保護作用，而當細胞過度自噬時，會引發細胞非凋亡性死亡，因此自噬又被稱為Ⅱ型細胞程序性死亡[10]。雖然這一觀點在過去的研究中一直存在爭議[11]，然而近期的研究表明，自噬在發育和病理性的細胞死亡中都發揮著重要作用[12]。SFI是我國臨床上常用的中藥材之一，在MIRI及其他心臟相關疾病中具有顯著療效[6]。SFI成分很多，具有復雜的分子機制。李麗靜等[7]研究表明，參附湯可降低大鼠缺氧復氧心肌細胞Beclin1的表達，從而抑制自噬，對心肌起保護作用，提示SFI可能通過調控自噬，減輕大鼠MIRI。本研究通過在體和離體實驗，對SFI調控自噬減輕大鼠MIRI的作用和機制進行了進一步研究。

為了判斷大鼠心肌的受損程度，本研究首先測定了大鼠血清CK、LDH、cTnⅠ水平，CK、LDH、cTnⅠ是常用的心肌損傷標記物，通常存在于胞質內，當心肌細胞發生損傷時，CK、LDH、cTnⅠ會從心肌細胞滲出到血液中，表現為血清CK、LDH、cTnⅠ水平升高[13]。本研究發現，SFI能夠顯著降低大鼠血清中CK、LDH、cTnⅠ的水平，其效果呈濃度依賴性變化，表明SFI減輕了MIRI對大鼠心肌造成的損傷，進一步對心肌梗死面積稱量和心肌組織病理切片觀察，檢測大鼠心肌細胞活性，發現SFI顯著減輕了大鼠心肌的梗死面積和病理變化，提高大鼠心肌細胞活性，與心肌損傷標記物測定的結果相符。

在MIRI中，炎癥介質參與了心肌損傷的過程，其中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和炎癥細胞因子在調控自噬中發揮著重要的作用。在心肌缺血階段，低氧、ATP耗竭造成的細胞器損傷可激活自噬，而在再灌注階段，氧化應激導致ROS大量產生，加重了細胞器損壞和脂質過氧化，導致了自噬的過度激活[14]。MDA是膜脂發生過氧化的重要產物之一，在氧化應激中水平升高，SOD是生物體重要的抗氧化酶，對清除ROS起著重要作用[15]。此外，白細胞對缺血心肌組織的浸潤，并大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥細胞因子，也加重了心肌損害[16]。本研究發現，SFI能夠顯著提高大鼠心肌組織和細胞內的SOD活性水平，抑制MDA的生成，且效果呈濃度依賴性變化，表明SFI能夠降低MIRI大鼠心肌氧化應激水平。此外，SFI同樣顯著降低了炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，且效果呈濃度依賴性變化，表明SFI緩解了MIRI的炎癥反應。上述結果表明SFI對心肌的保護作用是通過緩解炎癥和氧化應激實現的。

自噬是MIRI的重要病理機制之一，MIRI誘導的氧化應激、炎癥等均能增強心肌的自噬作用。當心肌缺血時，細胞通過自噬降解受損部位并獲得修復和再生的能量和原料，并通過阻斷線粒體誘發凋亡的途徑等方式保護心肌細胞[17,18]，而在再灌注期間，心肌細胞的自噬發生過度激活，心肌損傷進一步加重[19]。為了進一步探究SFI對自噬的調控作用，本研究對自噬相關蛋白進行了檢測，結果表明SFI顯著降低了心肌組織和細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率和Beclin1蛋白表達水平，提高了p62的蛋白表達水平，且效果呈濃度依賴性變化。LC3、Beclin1、p62三種蛋白通常作為自噬水平的檢測指標，Beclin1與PI3KCⅢ、Atg14形成三聚體，聚集自噬相關蛋白啟動自噬；LC3的活性形式LC3Ⅱ參與自噬體的延伸；p62可與待降解物結合，再與LC3Ⅱ形成復合物，最終定位于溶酶體內降解，p62會隨著自噬作用的增加而不斷被消耗[20,21]。結合實驗結果表明，SFI對MIRI大鼠心肌自噬作用的激活具有明顯的抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路對于自噬作用的激活具有重要調控作用，其中mTOR是PI3K/Akt下游最關鍵的自噬負調控因子。當mTOR表達受抑制時，ULK1復合體被激活，轉移到內質網上誘導自噬泡膜形成[22]。本研究發現，SFI能顯著提高心肌組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，從而抑制自噬作用的激活。雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑，是mTOR的特異負調控因子[23]，使用雷帕霉素抑制mTOR活性后發現，SFI對LC3Ⅱ的抑制作用顯著降低，心肌細胞的活力也顯著降低，表明SFI對MIRI大鼠心肌細胞自噬作用的抑制主要是通過激活自噬上游的PI3K/Akt/mTOR信號通路實現的。

綜上所述，SFI能夠通過抑制自噬作用的激活，下調自噬作用相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表達，上調p62的表達，在MIRI中保護心肌細胞，減輕細胞損傷，降低炎癥反應。本研究首次探究了SFI通過調控自噬對MIRI的作用機制，后期將對SFI調控各種自噬相關蛋白的作用機制展開深入研究。