pSS大鼠肺功能變化與Notch通路及調節性T細胞的關系①

王 坤 萬 磊 劉 健

(安徽中醫藥大學研究生院,合肥230031)

原發性干燥綜合征(primary Sjogren′s synd-rome,pSS)是成人常見的自身免疫性疾病，其特征在于腺體分泌異常，可以以不同的方式影響肺部。肺間質病變與pSS關系密切[1，2]，間質性肺病通常是pSS的肺部表現[3，4]。pSS的肺部受累導致肺間質病變和肺實質的破壞，最終導致肺功能降低[5]。輔助T細胞(Th)參與pSS肺功能損傷過程。Th1細胞主要分泌IL-2等，參與細胞炎癥反應；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5等，參與體液免疫應答。Th17細胞分泌效應因子IL-17，誘導炎癥反應，IL-17可通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應。Notch信號通路在肺間質病變中發揮作用[6]。Notch信號通路是一種高度保守的通路，對正常胚胎發育、細胞增殖、特化和分化至關重要，并與肺間質纖維化疾病有關[7]。Notch通路通過跨膜配體激活受體參與T細胞活化[8]。 Notch通路抑制劑可通過調節Th1和Th2細胞介導炎癥反應而減少肺部炎癥[9]。 Notch信號通路異常激活可致使成纖維細胞異常增殖，并分化為肌成纖維細胞和細胞外基質[10]，最終出現肺部病變導致肺功能降低。從Notch信號通路調節Treg角度觀察pSS肺功能變化，為進一步探討其可能的機制本研究設計如下方案。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級SD大鼠16只，體重(150±20)g，5～6月齡，購自安徽省實驗動物中心。IL-2、IL-5、IL-17、免疫球蛋白κJ區域(RBP-J)試劑購自上海源葉生物公司。流式細胞術試劑購自美國eBioscience公司。PCR試劑購自美國Invitrogen公司。免疫印跡相關試劑購自美國Abcam公司。頜下腺蛋白購自上海生扶生物。弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1pSS大鼠模型構建[11，12]大鼠隨機分為正常組和模型組。模型組大鼠兩后足足跖部皮下注射頜下腺蛋白與弗氏完全佐劑混合后的乳化物，0.2 ml/鼠。建立pSS模型。

1.2.2肺功能檢測 采用動物肺功能儀測定肺功能，包括一秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in 1 second,FEV1)、50%肺活量的最大呼氣流量(50% Forced expiratory flow,FEF50)、FEF75、用力最大呼氣流量(Peak expiratory flow,PEF)。

1.2.3IL-2、IL-5、IL-7、RBP-J表達 取大鼠新鮮血液，離心取上清液，檢測大鼠血清IL-2、IL-5、IL-17、RBP-J表達。根據ELISA操作步驟檢測IL-2、IL-5、IL-17、RBP-J OD值，繪制標準曲線，測算IL-2、IL-5、IL-17、RBP-J濃度。

1.2.4外周血Treg檢測 取大鼠新鮮血液100 μl，按106個細胞/管分別加入抗鼠CD4-FITC(0.25 μg)+抗鼠CD25-PE (0.25 μg)+抗鼠Notch1-APC(1.0 μg)，抗鼠CD4-FITC(0.25 μg)+抗鼠CD25-PE (0.25 μg)+抗Notch3-APC(1.0 μg)，陰性對照管加入相應同型對照抗體。依次進行固定、通透細胞，避光20～30 min；加紅細胞裂解液1 ml，避光15～25 min；離心棄上清，重懸于500 μl PBS液中，流式細胞術檢測。

1.2.5Notch通路相關基因和蛋白表達 基因檢測：根據GenBank 設計引物并合成。引物序列如下：Notch1上游5′-TCGTCTCCGACTTCGTCTATCA-3′，下游5′-TGCAGAGCAGACTTGCCTA-3′；Notch2上游5′-ATGGGCTCTAAGGTATTTCTGG-3′，下游5′-CAGAGCTCGCTTGTCGTG-3′；Notch3上游5′-CTCTGGTTTCCAGAGGGTTT-3′，下游5′-CCAGTTCGGTCAGTTCGTG-3′；Notch4上游5′-GGACTGGGAAAT-CCCGAACC-3′，下游5′-GGCATCTTTATCCGCTCCA-3′；Jagged1上游5′-GCATCGGCTCAGGGTCTG-3′，下游5′-AGTCGCCTGGGAGTTTGC-3′；Jagged2上游5′-GGGCTCTTGCCACGAAGT-3′，下游5′-AGGCACG-GTATCCCTTCG-3′；Delta1上游5′-CCTGGCGACCAC GCAACA-3′，下游5′-CAGCACCCTCCATTCCTG-3′；GAPDH上游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，下游5′-CCACAGTCCATGCCATCACT-3′。參照實驗步驟進行大鼠肺組織RNA的提取、逆轉錄及PCR反應。蛋白檢測：參考說明書進行肺組織蛋白提取、電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、蛋白檢測。數據分析處理：用掃描儀對膠片進行掃描、攝像；采用Quantity one 灰度分析軟件進行分析。計算各組條帶的灰度值，以目的蛋白與各組內參β-actin灰度值的比值做為蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1肺功能變化 與正常組比較，模型組大鼠FEV1等各項肺功能參數均有明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組肺功能參數比較 Fig.1 Comparison of lung function parameters of twogroupsNote: Compared with normal group,*.P<0.05.

圖2 兩組血清細胞因子IL-2、IL-5、IL-17和RBP-J水平比較Fig.2 Comparison of serum cytokines IL-2,IL-5,IL-17 and RBP-J level in two groupsNote: Compared with normal group,*.P<0.05,**.P<0.01.

GroupsCD4+CD25+TregCD4+CD25+Notch1+TCD4+CD25+ Notch3+TNormal14.67±5.9879.97±19.0983.31±19.69Model 7.07±3.361)63.25±19.371)70.58±20.381)

Note：Compared with normal group,1)P<0.01.

GroupsNotch1Notch2Notch3Notch4Delta1Jagged1Jagged2Normal0.87±0.250.90±0.390.51±0.200.85±0.250.54±0.90.49±0.190.48±0.19Model 0.94±0.360.93±0.410.97±0.252)0.87±0.210.90±0.132)0.93±0.182)0.74±0.201)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05，2)P<0.01.

圖3 肺組織 Notch 通路相關蛋白表達量Fig.3 Expression of Notch pathway related proteins in lung tissueNote: 1.Normal group;2.Model group.

2.2血清細胞因子 IL-2、IL-5、IL-17和RBP-J水平的變化 與正常組比較，模型組細胞因子IL-2、IL-17顯著升高，細胞因子IL-5及RBP-J降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

2.3外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Notch1+T和CD4+CD25+Notch3+T細胞變化 與正常組比較，模型組大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Notch1+T和CD4+CD25+Notch3+T細胞表達均降低(P<0.01)。見表1。

2.4肺組織Notch相關基因表達變化 與正常組相比,模型組Notch通路相關蛋白Notch3、Delta1、Jagged1、Jagged2表達升高(P<0.05或P<0.01)。見表2、圖3。

3 討論

T淋巴細胞在免疫疾病發病機制中具有重要作用，它涉及激活活化的CD4+T細胞以引發特異性效應細胞因子的分泌[13,14]。初始CD4+T細胞可以根據極化細胞因子信號分化成Th1、Th2和Treg。Th細胞參與炎性疾病的發生。CD4+T細胞分泌的炎癥細胞因子浸潤到氣道，黏液分泌過多，嗜酸性粒細胞聚集，導致免疫炎癥反應和肺部炎癥聚集。大量集聚的炎癥反應進一步致使肺功能參數FEV1、FEF、PEF降低。

Th1/Th2細胞因子穩定性是pSS肺損傷的重要指標。Th細胞在氣道炎癥中起作用。Th1細胞主要產生IL-2等。Th2細胞因子誘導嗜酸性粒細胞因子IL-5分泌而控制免疫反應，釋放炎癥介質。引起炎癥反應升高而損傷肺組織。Th17細胞釋放IL-17可誘導嗜酸性粒細胞浸潤和巨噬細胞募集，IL-17參與中性粒細胞積聚和中性粒細胞激活，細胞因子IL-17增加表明細胞浸潤和炎癥增加。本研究發現pSS大鼠細胞因子IL-2、IL-17顯著升高，細胞因子IL-5及RBP-J降低。Notch信號傳導途徑包括進化保守的細胞間通信系統，其在胚胎發育和成體期間控制細胞增殖、分化。 Notch信號通路在T細胞系發育的多個步驟中起著至關重要的作用，對于Th細胞分化十分關鍵。Notch通路也在調節Treg細胞分化中發揮作用[15]。Notch信號參與T細胞介導的免疫反應。研究表明，Notch信號傳導可促進Th2反應，Notch配體調節可以促進或抑制Th1反應[16]，Notch信號途徑調節T細胞向Th1方向分化[17]。研究發現在肺組織中特別是在CD4+T細胞中，Notch1 表達降低[18]，可上調肺組織中Th1/Th2比率。pSS炎癥可由Th2細胞因子IL-5介導。通過Notch 信號途徑可調節Th2細胞分泌IL-5，抑制炎癥反應而保護肺組織。

Notch通路可通過調控Treg表達而參與調節Treg功能。Notch 通路主要可調節Treg細胞的分化而介導免疫抑制作用。Notch1與其配體Jagged1結合后可誘導Treg分化，從而調節Treg細胞的數量。將CD4+T細胞轉染至Notch1受體胞內后，體內細胞因子平衡出現變化，如IL-1等促炎癥細胞因子表達升高。而采用抑制劑抑制Notch信號后，可顯著促進Treg分泌抑炎細胞因子IL-10，抑制促炎細胞因子IL-1β表達。Notch信號通路可以通過降低Treg細胞數量來介導免疫應答，加劇免疫炎癥反應。本研究發現與正常組比較，模型組外周血CD4+CD25+Treg表達降低，外周血CD4+CD25+Notch1+T細胞和CD4+CD25+Notch3+T細胞表達降低，而細胞因子IL-2、IL-17顯著升高。說明 Treg免疫耐受能力降低可能直接導致免疫炎癥產生。CD4+CD25+Treg細胞不但對pSS大鼠體內的炎癥反應有抑制作用，同時可抑制由炎癥引起的肺組織細胞損傷。

綜上所述，Notch信號通路可以通過降低Treg細胞數量，上調炎性細胞因子IL-2、IL-17表達，下調IL-5及RBP-J表達，促使T細胞向Th1方向分化，導致pSS炎癥反應升高，最終導致pSS肺功能降低。