西達本胺對腎癌786-O細胞增殖、凋亡與侵襲的影響及其機制①

顏國華 高 鵬 王世廣 王麗君

(鄭州工業應用技術學院，新鄭451100)

腎癌是來源于腎小管上皮細胞的腺癌，其中70%以上為腎透明細胞癌[1]。全世界每年新增腎癌患者約40.3萬例，每年死于腎癌者達17.5萬例[2]。由于腎癌缺乏可靠的診斷標志物和早期臨床癥狀，約30%的患者在確診時就已經發生轉移，這部分患者的中位生存期僅為1年[3]。腎癌對放化療不敏感，手術切除仍然是腎癌治療的主要手段，但術后存在較高的復發和轉移風險[4]。近年來，針對腎癌的分子靶向治療取得了快速發展。索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和阿昔替尼等腎癌靶向藥物已應用于臨床，然而臨床治療效果并不理想[5]。因此，研發新的靶向藥物仍然是目前腎癌治療領域的研究熱點之一。西達苯胺(Chidamide，CDM)是我國自主研發的首個選擇性組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor，HDACi)，通過表觀遺傳調控機制，在抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、逆轉耐藥腫瘤細胞多藥耐藥性、增強自然殺傷細胞和抗原特異性細胞毒T細胞介導的腫瘤殺傷作用等方面發揮抗腫瘤作用[6-9]。但目前關于CDM對腎癌細胞的抑制作用在國內外尚未見報道。本研究以人腎透明細胞癌786-O細胞和人正常腎小管上皮HKC細胞為實驗對象，旨在探究CDM對786-O細胞凋亡、增殖和侵襲的影響及其機制。本研究將為腎癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人腎透明細胞癌786-O細胞和人腎小管上皮HKC細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心；CDM(批號420001-201201，100 mg/支，純度≥99.5%)購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清和RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司；DMSO、PI、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；Matrigel基質膠和Transwell小室購自美國Corning公司；Edu-555細胞增殖檢測試劑盒、結晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin依賴激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、Bcl-2、Bax、基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP2)、MMP9、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 786-O細胞和HKC細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃、5% CO2條件下培養；當細胞覆蓋率達到80%時，用0.25 %的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

1.2.2藥物配置 將CDM溶于二甲基亞砜(Dime-thyl sulfoxide，DMSO)配制成100 mmol/L的儲備液，分裝后于-20℃保存；使用時用細胞培養液稀釋至所需濃度，其中DMSO終濃度為0.05%；對照組使用含0.05% DMSO的細胞培養液。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期786-O細胞和HKC細胞，以每孔5 000個的數量接種于96孔板；培養24 h后，實驗孔分別加入100 μl含不同濃度CDM(0.5、1、2、5、10、20 μmol/L)的細胞培養液，同時設調零孔和對照孔，每組設5個復孔；培養48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度A值；計算細胞活力，細胞活力=(實驗組A值-調零組A值)/(對照組A值-調零組A值)×100%；使用SPSS16.0軟件的Probit回歸模型計算CDM對786-O細胞的半數抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。實驗重復3次。

1.2.4EdU摻入法檢測細胞增殖 取對數生長期786-O細胞，以每孔5×105個的數量接種于6孔板，常規培養24 h后去上清，加入不同劑量CDM (0、5、10 μmol/L)處理48 h；加入1 ml用細胞培養液按1∶500 稀釋的EdU溶液，37℃孵育2 h；PBS洗滌2次，加入1 ml固定液，室溫固定15 min；PBS洗滌2次，加入1 ml通透液，室溫孵育15 min；PBS洗滌2次，加入0.5 ml Click反應液，室溫避光孵育 30 min；PBS洗滌2次，使用流式細胞儀檢測EdU陽性細胞比例。實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期 細胞處理同1.2.4，收集各組細胞，PBS洗滌2次；加入1 ml 70%冰乙醇于4℃固定24 h；PBS洗滌2次，加入碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色液，4℃避光染色30 min；使用流式細胞儀分析細胞周期。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞處理同1.2.4，收集各組細胞，用PBS洗滌2次；重懸細胞于400 μl Annexin V-FITC結合液中，加入5 μl AnnexinV-FITC，4℃避光孵育15 min；加入10 μl PI染色液，4℃避光孵育15 min；使用流式細胞儀分析檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.2.7Transwell法檢測細胞侵襲 將Matrigel基質膠與RPMI1640培養基按1∶6 稀釋，取50 μl均勻鋪到Transwell小室的底部，然后將Transwell小室放入24孔板中，于37℃孵育過夜使其成凝膠狀；向小室下方的24孔板中加入600 μl細胞培養液，向小室內加入經不同劑量CDM(0、0.5、1 μmol/L)處理48 h后的786-O細胞(細胞數量為4 000個/孔)，37℃孵育12 h；取出小室，用棉簽擦去小室內的Matrigel基質膠和細胞，PBS洗滌2次，甲醛固定30 min；PBS洗滌2次，結晶紫染色20 min；PBS 洗滌2次，顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞，隨機挑選5個視野拍照計數；計算侵襲率，侵襲率(%)=(實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數)×100%。實驗重復3次。

1.2.8Western blot法檢測蛋白水平 收集各組細胞，用RIPA裂解各組細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL進行發光反應，暗室X膠片顯影，拍照，使用Image J1.45s軟件進行灰度分析。以目標蛋白與內參β-actin的灰度比作為目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1CDM對細胞活力的影響 如圖1所示，與對照組相比，不同劑量CDM(0.5、1、2、5、10、20 μmol/L)處理48 h后，786-O細胞活力明顯下降(P<0.05)，且隨著CDM劑量的增加呈下降趨勢，IC50為11.83 μmol/L；而HKC細胞活力在20 μmol/L濃度作用下才明顯降低(P<0.05)。這表明CDM對人正常腎小管上皮HKC細胞的毒性作用較小，但對人腎透明細胞癌786-O細胞具有較強的毒性作用，并呈劑量依賴性。

2.2CDM對786-O細胞增殖的影響 如圖2所示，與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L CDM組細胞的EdU陽性率顯著降低(P<0.05)；同時，10 μmol/L CDM組細胞的EdU陽性率顯著高于5 μmol/L CDM組(P<0.05)。這表明CDM可劑量依賴性地抑制786-O細胞增殖。

2.3CDM對786-O細胞周期的影響 如圖3所示，與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L CDM組G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.05)，G0/G1期和S期細胞比例明顯降低(P<0.05)；與5 μmol/L CDM組相比，10 μmol/L CDM組G2/M期細胞比例顯著升高(P<0.05)，G0/G1期和S期細胞比例明顯降低(P<0.05)。這表明CDM可誘導786-O細胞發生G2/M期阻滯，且呈劑量依賴性。

圖1 786-O和HKC細胞活力的變化Fig.1 Changes of cell viability in 786-O and HKC cellsNote: *.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 2 μmol/L CDM group；△.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group；▲.P<0.05 versus 10 μmol/L CDM group.

2.4CDM對786-O細胞凋亡的影響 如圖4所示，與對照組相比，5 μmol/L和10 μmol/L CDM組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；10 μmol/L CDM組細胞凋亡率顯著高于5 μmol/L CDM組(P<0.05)。這表明CDM可劑量依賴性地誘導786-O細胞凋亡。

2.5CDM對Cyclin B1、CDK1、Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響 如圖5所示，與對照組相比， 5 μmol/L和10 μmol/L CDM組細胞中Cyclin B1、CDK1和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；且5 μmol/L和10 μmol/L CDM組間Cyclin B1、CDK1、Bcl-2和Bax蛋白表達水平的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 CDM抑制786-O細胞增殖Fig.2 CDM inhibits proliferation of 786-O cellsNote: A.EdU assay；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

圖3 CDM阻滯786-O細胞于G2/M期Fig.3 CDM arrests cell cycle of 786-O cells at G2/M phaseNote: A.Cell cycle analysis；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；**.P<0.01 versus control group;#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

圖4 CDM誘導786-O細胞凋亡Fig.4 CDM induces apoptosis of 786-O cellsNote: A.Apoptosis detection；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

圖5 CDM對786-O細胞Cyclin B1、CDK1、Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of CDM on protein expression of Cyclin B1,CDK1,Bcl-2 and Bax in 786-O cellsNote: A.Western blot assay；B.Statistical analys.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 5 μmol/L CDM group.

2.6CDM對786-O細胞侵襲的影響 在采用Transwell法檢測細胞侵襲時，為避免因藥物劑量過大對細胞活力產生的抑制作用，本研究選擇對細胞活力未產生明顯抑制作用的0.5和1 μmol/L兩個濃度。如圖6所示，與對照組相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L CDM組細胞侵襲率顯著降低(P<0.05)；同時，1 μmol/L CDM組細胞侵襲率顯著高于0.5 μmol/L CDM組(P<0.05)。這表明CDM可劑量依賴性地抑制786-O細胞侵襲。

2.7CDM對MMP2和MMP9蛋白表達水平的影響 如圖7所示，與對照組相比，0.5 μmol/L和1 μmol/L CDM組細胞中MMP2和MMP9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；同時，1 μmol/L CDM組細胞中MMP2和MMP9蛋白表達水平顯著低于0.5 μmol/L CDM組(P<0.05)。

圖6 CDM抑制786-O細胞侵襲Fig.6 CDM inhibits invasion of 786-O cellsNote: A.Transwell assay；B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 0.5 μmol/L CDM group.

圖7 CDM對786-O細胞MMP2和MMP9蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of CDM on protein expression of MMP2 and MMP9 in 786-O cellsNote: A.Western blot assay；B.Statistical analys.*.P<0.05 versus control group；#.P<0.05 versus 0.5 μmol/L CDM group.

3 討論

目前，在中國臨床上已經普及應用的腎癌靶向治療藥物有索拉非尼、舒尼替尼、阿昔替尼和培唑帕尼。這4種藥物均以血管內皮生長因子受體為靶點，通過抗腫瘤血管生成發揮抗腫瘤作用。盡管腎癌靶向治療藥物有效提高了晚期腎癌患者的客觀緩解率及無進展生存期，但仍具有一定毒副作用，并且患者最終幾乎都會出現耐藥[10]。HDACi可通過特異性調節組蛋白乙酰化水平以逆轉腫瘤發生與進展過程中的表觀遺傳學改變，憑借其顯著的治療效果和較小的毒副作用，成為目前受國內外學者廣泛關注的、最有前景的一類抗腫瘤藥物[11]。

由我國自主研發的CDM是全球首個獲準上市的亞型選擇性HDACi，目前已批準用于治療外周T細胞淋巴瘤。最近的研究表明，CDM對多種腫瘤細胞具有抑制作用，如多發性骨髓瘤、白血病、腺樣囊性癌、肺癌和胰腺癌等，因而成為有潛力的抗腫瘤藥物[12-16]。本研究發現，CDM對人腎透明細胞癌786-O細胞具有顯著的毒性作用，IC50為11.83 μmol/L，并呈劑量依賴性地抑制786-O細胞增殖和誘導其凋亡。

腫瘤細胞以有絲分裂的方式進行增殖，從一次有絲分裂完成到下一次有絲分裂結束所經歷的全過程稱為細胞周期，分為G0/G1期、S期和G2/M期。每個時期具有各自特征性的Cyclin，而Cyclin可激活特定的CDK，磷酸化相應的底物，使細胞周期順序推進[17]。在G2期，Cyclin B1與CDK1形成的復合物稱為成熟促進因子(Maturation promoting factor，MPF)，它可以使細胞從G2期進入M期[18]。近年來有研究發現，CDM可阻滯多種腫瘤細胞于G2/M期，如白血病、腺樣囊性癌、肺癌和胰腺癌[13-16]。本研究證實，高劑量CDM誘導786-O細胞發生G2/M期阻滯，這可能與其劑量依賴地下調Cyclin B1和CDK1蛋白表達水平有關。

Bcl-2蛋白家族在調控細胞凋亡過程中發揮著重要作用[19，20]。Bcl-2蛋白家族以功能可以分為兩大類：一類是抗凋亡蛋白，主要有Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl和骨髓細胞白血病因子1等；另一類是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bad、Bak和Bid等。Bax可通過插入線粒體外膜并聚合成孔道，或與線粒體外膜的電壓依賴性離子通道結合致使線粒體通透性轉換孔持續開放，觸發線粒體外膜透化，使線粒體膜間腔中的多種促凋亡蛋白釋放至胞漿，導致細胞凋亡[21]。定位在線粒體外膜上的Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡[19]。本研究發現高劑量CDM可劑量依賴性地誘導786-O細胞凋亡，這可能與其下調Bcl-2蛋白表達以及上調Bax蛋白表達有關。

細胞外基質和基底膜是限制腫瘤細胞侵襲和轉移的重要屏障，但腫瘤細胞可通過分泌多種MMPs降解細胞外基質和基底膜從而侵入周邊組織，并穿入血管和淋巴管向遠處轉移。MMPs屬于鋅依賴性內肽酶家族，其中MMP2和MMP9主要降解Ⅳ型膠原蛋白，而Ⅳ型膠原蛋白正是構成細胞外基質和基底膜的主要成分。Sitaram等[22]研究證實，MMP抑制劑TAPI-2可阻斷轉化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)誘導的腎癌786-O細胞和A498細胞侵襲。本研究發現，低毒劑量CDM可抑制786-O細胞侵襲，這可能與其劑量依賴性地下調MMP2和MMP9蛋白表達有關。

綜上所述，CDM可在體外劑量依賴性抑制人腎癌786-O細胞增殖和侵襲，并引起G2/M期阻滯和誘導細胞凋亡，這可能與其下調Cyclin B1、CDK1、Bcl-2、MMP2和MMP9蛋白表達，以及上調Bax蛋白表達有關。這將為CDM用于治療腎癌提供新的理論依據。