miR-296-5p靶向MICB促進口腔鱗癌生長的分子機制①

王藜篥 張 濤 金 珊 周祥文 王 青 姚雨彤 楊扉扉

(貴州省骨科醫院，貴陽550004)

MHCⅠ類相關蛋白(Major histocompatibility complex,MHC)包括主要組織相容性蛋白A/B (MICA/B)，均位于6號染色體，由3個胞外區、1個跨膜區、1個胞質尾區構成[1，2]。MICA/B主要存在于上皮細胞及腫瘤細胞的細胞膜，也有少量研究報道其主要位于細胞質，極少部分位于癌細胞膜[3]。MICA/B可通過與NK 細胞上自然殺傷細胞受體蛋白2D (Natural killer cell receptor protein 2D,NKG2D)結合活化效應細胞，參與抗感染、抗腫瘤、移植排斥、自身免疫及腫瘤的免疫逃避作用[4]。2007年馬烽等[5]報道，MICB(Major Histocompati-bility complex classⅠ-related chain B)是NK細胞活化受體NKG2D的配基，可在應激作用下與NKG2D作用，在NK細胞對病毒感染細胞和腫瘤細胞的殺傷中具有重要的作用。MICB在多種癌癥中均參與腫瘤的發生發展[6]，但其在口腔癌中的作用機制尚未十分清楚。miRNA可通過調節轉錄和轉錄后水平控制細胞的生物學行為，其在癌癥中的作用已成為該領域的研究熱點[7]。miR-296-5p在很多癌癥中均發生異常表達，但其在口腔鱗癌的研究甚少[8]。本研究檢測口腔鱗癌組織中miR-296-5p、MICB的表達并采用口腔鱗癌細胞Cal27，觀察抑制miR-296-5p、過表達MICB、敲減MICB對口腔鱗癌細胞存活率、NK細胞因子TNF-α、IFN-γ含量的影響，揭示miR-296-5p可調控口腔鱗癌細胞的存活及NK細胞的殺傷能力，其機制可能與靶向MICB有關，可為口腔鱗癌的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1材料 選取本院2017年2月至2018年6月期間外科手術切除的口腔鱗狀細胞癌標本41例及癌旁組織標本30例作為對照。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書；口腔鱗癌細胞Cal27、NK細胞購自ATCC；DMEM培養基、胎牛血清、5-二苯基四氮唑溴鹽、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR購自大連TaKaRa公司；辣根過氧化物氧化酶(HRP)標記的羊抗人IgG購自上海申能博彩公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒、人干擾素γ(IFN-γ)檢測試劑盒購自碧云天公司；MICB兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司；免疫組織化學試劑購自北京中杉公司；

1.2方法

1.2.1免疫組織化學實驗 將來源本院的41例口腔鱗癌組織和30例癌旁組織用石蠟包埋，切成0.4 μm 的切片。然后按照SP法進行免疫組織化學染色。染色后將切片浸入3%H2O2中室溫避光孵育10 min，PBS洗滌4次，置入枸杞酸鈉-EDTA抗原修復液中，用微波爐加熱20 min進行抗原修復，自然冷卻。再用PBS洗片并吸去水分，滴加Ⅰ抗并置于4℃孵育過夜。取出切片沖洗后吸干水分，滴加Ⅱ抗，濕盒內室溫孵育30 min，PBS沖洗，除去多余水分，滴加DAB顯色劑，5 min后顯微鏡下觀察染色效果，自來水終止反應。滴加蘇木精染核5 min，終止反應。光學顯微鏡下讀片，記錄染色的強度，封固。用PBS緩沖液代替Ⅰ抗作為陰性對照。結果判定：400倍顯微鏡下每張玻片隨機選取5個視野觀察染色強度和陽性細胞數。陽性細胞率=(陽性細胞數/癌細胞總數)×100%。當陽性細胞率≥ 50%時，判定為陽性。

1.2.2細胞培養和轉染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養口腔鱗癌細胞Cal27、NK細胞，置于37℃,5%CO2的培養箱中常規培養。將anti-miR-con組(轉染anti-miR-con)、anti-miR-296-5p組(轉染anti-miR-296-5p)、miR-con組(轉染miR-con)、miR-296-5p組(轉染miR-296-5p mimics)、pcDNA 3.1組(轉染pcDNA 3.1)、pcDNA 3.1-MICB組(轉染pcDNA 3.1-MICB)、anti-miR-296-5p+si-con組(anti-miR-296-5p和si-con共轉染)、anti-miR-296-5p+si-MICB組(anti-miR-296-5p和si-MICB共轉染)，均按照LipofectamineTM2000脂質體說明書要求轉染至Cal27細胞，轉染48 h，用qRT-PCR檢測轉染效率。轉染成功后，用于后續實驗。

1.2.3qRT-PCR實驗 Trizol法提取組織樣本或對數生長期的1.2.2中各組細胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計進行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉錄反應采用逆轉錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進行，合成模板鏈cDNA。按照反應體系進行，每個樣品重復3次，取平均值，反應結束后通過分析Ct值，計算定量結果，以2-ΔΔCt法測定miR-296-5p的相對表達水平。

1.2.4MTT實驗 將1.2.2中各組細胞濃度調整至5×104個/ml取100 μl，加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，培養4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩，使結晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞的存活率=OD490樣品/OD490對照。

1.2.5ELISA實驗 將1.2.2中各組細胞濃度調整至5 ×104個/ml取100 μl，按照TNF-α檢測試劑盒、IFN-γ檢測試劑盒說明書要求進行TNF-α、IFN-γ的檢測。

1.2.6Western blot實驗 取1.2.2中各組細胞1×106個，RIPA裂解后用BCA法進行定量，變性離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western blot實驗常規操作流程進行電泳-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白MICB的表達。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗 取1.2.2中各組細胞1×106個，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊要求操作。psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內參，psiCHECK2-MICB-3′UTR WT和psiCHECK2-MICB-3′UTR MUT的表達為對照，轉染24 h后，檢測熒光強度。海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值即反映miR-296-5p與MICB的結合力。

2 結果

2.1口腔鱗狀細胞癌中miR-296-5p、MICB的表達 運用免疫組織化學法檢測癌旁組織、口腔鱗狀細胞癌組織中MICB的蛋白表達，與癌旁組織相比，口腔鱗狀細胞癌組織中MICB的蛋白表達顯著降低(圖1A、B)。qRT-PCR檢測癌旁組織、口腔鱗狀細胞癌組織中miR-296-5p的表達，與癌旁組織相比，口腔鱗狀細胞癌組織中miR-296-5p的表達顯著升高(表1)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.2抑制miR-296-5p與NK細胞共培養對口腔鱗癌細胞存活率的影響 運用MTT法檢測細胞的存活率，qRT-PCR法檢測細胞中miR-296-5p的表達，與anti-miR-con組相比， anti-miR-296-5p組細胞中miR-296-5p的表達顯著降低，細胞存活率顯著降低(表2)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 口腔鱗癌組織41例及癌旁組織30例中MICB的蛋白表達(免疫組化染色，×400)Fig.1 Protein expression of MICB in oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues (Immunohistoche-mical staining,×400)

2.3抑制miR-296-5p與NK細胞共培養對NK細胞因子的影響 用ELISA實驗檢測anti-miR-con組、anti-miR-296-5p組細胞中IFN-γ、TNF-α的含量。與anti-miR-con組相比，anti-miR-296-5p組細胞中IFN-γ、TNF-α的含量均顯著升高(表3)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4miR-296-5p靶向MICB 通過Target scan對miR-296-5p與MICA進行預測，發現miR-296-5p靶向MICA結合的可能性很高(圖2A)。運用雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞的熒光活性，與miR-con組相比，miR-296-5p組WT-MICA細胞的熒光活性顯著降低，而MUT-MICA細胞的熒光活性不受影響(表4)。與miR-con組相比，miR-296-5p組細胞中MICA的蛋白表達顯著降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-296-5p組細胞中MICA的蛋白表達顯著升高(圖2B，表5)，差異均具有統計學意義(P<0.05)?？梢?，miR-296-5p可靶向MICB。

表1 口腔鱗狀細胞癌中miR-296-5p、MICB的表達

Tab.1 Expression of miR-296-5p and MICB in oral squa-mous cell carcinoma

GroupsmiR-296-5pNormal1.00±0.18Cancer3.69±0.441)t9.801P0.001

Note：1)P<0.05.

表2 抑制miR-296-5p對口腔鱗癌細胞存活率的影響

Tab.2 Effect of inhibition of miR-296-5p on survival rate of oral squamous cell carcinoma

GroupsmiR-296-5pCell survival rate(%)anti-miR-con1.02±0.1564.31±6.76anti-miR-296-5p0.43±0.061)37.96±3.691)t6.3265.926P0.0030.004

Note：1)P<0.05.

表3 抑制miR-296-5p對NK細胞因子的影響

Tab.3 Effect of inhibition of miR-296-5p on NK cytokines

GroupsIFN-γ (pg/ml)TNF-α (pg/ml)anti-miR-con52.06±6.2834.14±3.66anti-miR-296-5p148.43±8.731)112.49±11.841)t15.52110.950P0.0000.000

Note：1)P<0.05.

圖2 miR-296-5p靶向MICBFig.2 miR-296-5p targeted MICBNote: A.Complementary sequence;B.miR-296-5p affects the expression of MICB protein in oral cancer cells.

表4 miR-296-5p對口腔癌細胞熒光活性的影響

Tab.4 Effect of miR-296-5p on fluorescence activity of oral cancer cells

GroupsWT-MICAMUT-MICAmiR-con1.00±0.110.96±0.08miR-296-5p0.34±0.051)1.05±0.12t9.4611.081P0.0010.341

Note：1)P<0.05.

表5 MICB蛋白水平的表達

Tab.5 Expression of MICB protein levels

GroupsMICB protein expressionmiR-con1.00±0.09miR-296-5p0.41±0.051)anti-miR-con1.06±0.11anti-miR-296-5p1.86±0.142)F100.622P0.000

Note：Compared with miR-con group,1)P<0.05;compared with anti-miR-con group,2)P<0.05.

2.5過表達MICB與NK細胞共培養對口腔鱗癌細胞存活率和NK細胞因子的影響 Western blot檢測pcDNA組、pcDNA-MICB組細胞中MICB的蛋白表達(圖3)。與pcDNA組相比，pcDNA-MICB組細胞中MICB的蛋白表達顯著升高，細胞存活率顯著升高，NK細胞因子IFN-γ、TNF-α 的含量顯著升高(表6)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.6敲減MICB與NK細胞共培養對口腔鱗癌細胞存活率和NK細胞因子的影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-296-5p組細胞中MICB蛋白表達量顯著升高(圖4)，細胞存活率顯著降低，NK細胞因子IFN-γ、TNF-α 的含量顯著升高(表7)；與anti-miR-296-5p+si-con組相比，anti-miR-296-5p+si-MICB組細胞中MICB蛋白表達量顯著降低(圖4)，細胞存活率顯著升高，NK細胞因子IFN-γ、TNF-α 的含量顯著降低(表7)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測MICB蛋白水平的表達Fig.3 Western blot analysis of MICB protein expression

圖4 Western blot檢測MICB蛋白水平的表達Fig.4 Western blot analysis of MICB protein expression

表6 過表達MICB與NK細胞共培養后對口腔鱗癌細胞存活率和NK細胞因子的影響

Tab.6 Effect of overexpression of MICB and NK cells on survival rate and NK cytokines of oral squamous cell carcinoma

GroupsMICB protein expressionCell survival rate(%)IFN-γ (pg/ml)TNF-α (pg/ml)pcDNA1.00±0.0961.89±5.9155.25±4.7638.47±4.21pcDNA-MICB2.43±0.311)29.53±4.851) 172.46±13.351) 145.23±12.861)t7.6737.33114.32413.665P0.0020.0020.0000.000

Note：1)P<0.05.

表7 敲減MICB與NK細胞共培養對口腔鱗癌細胞存活率和NK細胞因子的影響

Tab.7 Effect of knockdown of MICB and NK cell co-culture on survival rate and NK cytokines of oral squamous cell carcinoma

GroupMICB protein expressionCell survival rate(%)IFN-γ (pg/ml)TNF-α (pg/ml)anti-miR-con1.00±0.0762.67±7.5153.32±6.1436.52±4.16anti-miR-296-5p2.21±0.271)33.49±3.561)144.43±8.961)108.96±10.701)anti-miR-296-5p+si-con2.42±0.2335.76±3.14141.33±12.87110.46±9.64anti-miR-296-5p+si-MICB1.34±0.182)51.64±4.692)79.47±8.162)56.16±6.212)F34.11122.63070.77863.956P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the anti-miR-con group,1)P<0.05;compared with the anti-miR-296-5p+si-con group,2)P<0.05.

3 討論

惡性腫瘤是目前世界上人類死亡的首要原因，且癌癥的發病率仍在逐年上升[9]。當前針對癌癥的主要方法，如手術治療、化療、放療均不能完全根除或殺滅腫瘤細胞。微小RNA是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的內源性短鏈非編碼小分子RNA，其本身無開放閱讀框，不編碼蛋白[10]。近幾年微小RNA在腫瘤中的研究日益增多，發現了大量在人類腫瘤中具有治療潛能的miRNA[11]。miR-495、miR-26b、miR-139-5p均在口腔鱗癌中具有重要作用[12-14]。Zhu等[15]發現，miR-296的異常表達在人類各種惡性腫瘤的細胞過程中均具有重要作用，包括細胞增殖、細胞凋亡、侵襲和上皮-間質轉化。Severino等[16]對轉移性和非轉移性口腔鱗狀細胞癌患者的血漿和組織進行miRNA測序發現，在轉移性腫瘤中檢測到miR-181和miR-296，并在發生轉移的患者血漿中檢測到miR-296，這提示了miRNA具有診斷口腔鱗狀細胞癌轉移的潛力。本研究運用qRT-PCR法檢測了口腔鱗癌組織中miR-296-5p的表達，發現miR-296-5p在口腔鱗癌中高表達，這與前人的研究結果相吻合；深入研究發現，抑制miR-296-5p可下調口腔癌細胞的存活率，促進NK細胞因子的分泌；另外，用雙熒光素酶報告基因檢測驗證了miR-296-5p靶向負調控MICB。

免疫監測是免疫反應的重要組成部分，不僅對于病原體，對于癌癥更是如此。細胞毒性淋巴細胞(包括NK細胞和CD8+T細胞)可以作為癌細胞發展狀態的標志物[17]。Ⅱ 型C凝集素樣受體在自然殺傷細胞、CD8+T細胞和γδT細胞上均有表達，其可作為細胞表面的一個重要的激活性受體[18]。MICB為NKG2D的配體之一，是參與免疫相關基因的成員，主要在上皮細胞、內皮細胞和腫瘤細胞的細胞膜上表達，與腫瘤逃避、免疫排斥、自身免疫等疾病相關[19]。研究顯示 MICA 和 MICB 基因編碼區間序列同源性大于 90%，MICA 和 MICB 蛋白間具有相同或相似的保守區域[20]。MICA能夠競爭性與NK細胞的活化性受體 NKG2D 結合進而阻礙NK細胞的免疫監視，發揮腫瘤逃逸作用[21]。早在2007，中國研究者Liu等[22]在口腔鱗狀細胞癌的研究中闡明，口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)細胞系中內源性MICB mRNA表達顯著高于人正?？谇唤琴|上皮細胞NHOK中的表達，在OSCC組織中MICB mRNA表達高于癌旁正常組織，提示MICB在口腔鱗狀細胞癌中可能高表達。楊輝俊等[23]在口腔鱗癌患者外周血中檢測NKT細胞、NKG2D及其配體MICA/B的表達，發現口腔鱗癌患者外周血中NKT細胞數量和NKG2D及其配體MICA/B表達均下調，以利于口腔鱗癌細胞發生免疫監視。本研究運用免疫組織化學法檢測了口腔癌組織中MICB的蛋白表達，發現MICB在口腔癌中表達顯著降低，這與楊輝俊的研究結果相一致；進一步深入研究發現，過表達MICB可抑制口腔鱗癌細胞存活，促進NK細胞因子分泌，發揮抑癌作用，且敲減MICB可逆轉抑制miR-296-5p對口腔鱗癌細胞存活率的抑制及對NK細胞因子含量的促進作用。

綜上所述，miR-296-5p可調控口腔鱗癌細胞的存活和NK細胞的殺傷作用，其機制可能與靶向MICB有關，為口腔鱗癌的預防和治療提供新靶點。