兩種復合菌制作天然腌制灌腸效果研究

李沛然，朱迎春，楊華，梁麗雅，馬儷珍，*

（1.天津農學院總務處，天津300384；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中030801；3.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津300384；4.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

隨著人們對綠色食品的需求越來越高，綠色腌肉制品的開發逐漸成為研究熱點，根據國內外相關準則規定，綠色和有機肉制品生產過程中不允許加入化學合成型試劑亞硝酸鹽[1-3]，但是亞硝酸鈉作為腌肉制品中必須使用的食品添加劑，對腌肉制品發色、抑制肉毒梭狀芽孢桿菌等方面有良好的作用，目前還沒有發現可以完全替代亞硝酸鹽作用的物質[4-5]。如何做到既能發揮亞硝酸鹽對腌肉制品的安全保障作用，又能滿足綠色有機腌肉制品的生產需要，成為困擾綠色腌肉制品生產的一大難題。近幾年有國外學者提出“天然腌制”的新思路，其原理是利用具有硝酸鹽還原作用并可應用于肉制品加工中的微生物，將天然來源的硝酸鹽（比如蔬菜）轉化為天然型的亞硝酸鹽，從而替代傳統人工合成型亞硝酸鹽制作腌肉制品。Krause 利用具有硝酸鹽還原作用的肉葡萄球菌去發酵硝酸鹽含量很高的蔬菜，將發酵后的蔬菜粉制作灌腸并研究效果。目前，應用在肉制品領域的商業開發復合菌種較多，部分菌種具有硝酸鹽還原能力，但是在天然腌制領域利用較少，如何利用商業化復合菌種生產天然腌肉制品，對于工廠生產具有一定現實意義[6-7]。

本文以意大利SACCO 公司的WBL-45 復合菌種和VBL-97 復合菌種為研究對象，制作芹菜發酵液，通過改變復合菌種添加量和發酵時間，研究發酵芹菜汁中硝酸鹽、pH 值和亞硝酸鹽的變化規律，確定兩種復合菌生成天然亞硝酸鹽最佳發酵條件，再分別以這兩種復合菌制作的發酵芹菜粉加工灌腸，以成品的亞硝酸鹽殘留、脂肪氧化值和色澤為指標，與合成型亞硝酸鹽制作灌腸對比，研究兩種發酵芹菜粉灌腸的品質效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原材料

芹菜、豬背最長肌和豬肥膘：天津侯臺農貿市場。

1.1.2 試驗菌

SACCO VBL-97 菌株和 SACCO WBL-45 菌株：意大利SACCO 公司；薩科VBL-97 菌株總菌數3.75×1010CFU/g 由木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus） 和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）組成。薩科WBL-45 菌株總菌數4.25×1010CFU/g由肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）組成。

1.1.3 試劑與調料

乙酸鋅、硼砂、鹽酸奈乙二胺、亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸等（均為分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；桂皮、淀粉、胡椒粉、食鹽、亞硝酸鹽、味精等（均為食品級）：天津中英保健食品股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

恒溫振蕩器（Bluepard THZ-98AB）：上海-恒科學儀器有限公司；高壓滅菌鍋（SX-300）：日本國東京TOMY 公司；電子天平（BS 224S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；pH 計（PB—10）：Sartorius 公司；榨汁機（All Basic S25）：IKA 公司；離心機（ST40R）：德國Theromo Scientific；紫外分光光度計（UV-1800）：日本島津公司；絞肉機（BJ-MM12）：廣東省韶關北江機電廠；色差儀（CM-5）：KONICA MINOLTA 公司；高速剪切分散乳化機（FA25）：德國弗魯克公司。

1.3 試驗設計

1.3.1 發酵芹菜液

芹菜液制作：芹菜經浸泡、清洗、去葉、切段、榨汁后制得。

芹菜發酵液的配制：①VBL-97 芹菜發酵液配制：準備35 個500 mL 三角瓶，平均分為5 組，5 組三角瓶的菌種添加量依次為 5、10、50、200、500 mg，所有瓶中加入葡萄糖24 g，芹菜汁150 g，最后用無菌水補充至總重量為300 g，使VBL-97 菌株的接種量分別達到6.25×105、1.25×106、6.25×106、2.5×107、6.25×107CFU/g。將5 組芹菜發酵液于38 ℃恒溫振蕩器中發酵150 h（150 r/min），分別在第 0、12、24、60、96、120 h 和 150 h從每組中取出一個樣品，測定其亞硝酸鹽、硝酸鹽含量及pH 值。②WBL-45 芹菜發酵液配制：配制方法同①，使 WBL-45 菌株接種量分別達到 7.08×105、1.42×106、7.08×106、2.83×107、7.08×107CFU/g。最后按照亞硝酸鹽轉化量最高時的菌種添加濃度和發酵時間點，分別制作VBL-97 和WBL-45 芹菜發酵液，冷凍干燥后得到發酵芹菜粉備用。

1.3.2 灌腸的制作

將7.2 kg 豬背最長肌用絞肉機絞碎，2.7 kg 豬肥膘手工切成0.2 cm～0.3 cm 見方肥丁，按對照組、試驗組 1（VBL-97）、試驗組 2（WBL-45）將瘦肉和肥肉丁平均分為3 份，首先進行瘦肉腌制：對照組（CK）加入100 mg/kg 亞硝酸鈉和2%食鹽拌勻，試驗組（VBL-97）加入1%VBL-97 凍干發酵芹菜粉和2%食鹽拌勻（以瘦肉重計），試驗組（WBL-45）加入 1%WBL-45 凍干發酵芹菜粉和2%食鹽拌勻（以瘦肉重計）。3 組瘦肉攪拌混勻1 min 后，在4 ℃條件下腌制16 h。腌制結束后，各組均添加肥膘30%、味精2%、胡椒粉0.2%、豆蔻粉0.1%、水5%（以瘦肉重計），攪拌均勻后灌腸，經結扎、漂洗、針刺排氣后，掛入煙熏爐50 ℃烘烤1 h，后在80 ℃～85 ℃水中煮制，確保中心溫度達到72 ℃后停止加熱，放入烤爐里50 ℃干燥1 h，冷卻后真空包裝，分別在冷藏的第0 天、第1 天、第3 天、第5 天和第7天測定各項指標。

1.4 指標測定方法

1.4.1 亞硝酸鹽含量的測定

參考GB 5009.33-2010 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法[8]。

1.4.2 硝酸鹽含量的測定

參考NY/T 1279-2007《蔬菜、水果中硝酸鹽的測定》測量方法[9]。

1.4.3 pH 值的測定

從發酵液中取3 mL～5 mL，攪勻，將pH 計探頭置于發酵液中部，讀取pH 值數值。

1.4.4 硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的測定

參考文獻[10]中方法。

1.4.5 色澤測定

用色差儀測定樣品的a*值。

1.4.6 數據分析

使用Statistix8.1 軟件進行顯著性分析，使用Tukey HSD 比較方法，α 為 0.05 或 0.01。

2 結果與分析

2.1 WBL-45芹菜發酵液和VBL-97芹菜發酵液中pH值、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量的測定

WBL-45 芹菜發酵液和VBL-97 芹菜發酵液中pH 值、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量的測定見圖1～圖3。

圖1 WBL-45 發酵芹菜液和VBL-97 芹菜發酵液中pH 值的測定Fig.1 The pH value determination of celery juice treated by WBL-45 and VBL-97

圖2 WBL-45 發酵芹菜液和VBL-97 芹菜發酵液中硝酸鹽含量的測定Fig.2 The nitrate determination of celery juice treated by WBL-45 and VBL-97

從圖1、圖2 和圖3 可以看出，一方面酸性代謝產物積累，pH 值持續下降，另一方面發酵菌株的抑制作用增強，硝酸鹽還原作用持續降低，發酵至24 h 左右時，pH 值和硝酸鹽降低至最低點，同時亞硝酸鹽生成量到最高點，且當WBL-45 接種量為1.42×106CFU/g，亞硝酸鹽的生成量最高，達到1 013 mg/kg，VBL-97接種量為1.25×106CFU/g 時，亞硝酸鹽峰值含量最大，達到256 mg/kg，因此WBL-45 初步選用接種量為1.42×106CFU/g、發酵時間為 24 h、發酵溫度為 38 ℃來制作發酵芹菜液，VBL-97 初步選用接種量為1.25×106CFU/g、發酵時間為24 h、發酵溫度為38 ℃來制作發酵芹菜液，并將此兩種發酵芹菜液凍干成粉應用于后期灌腸制作。

2.2 灌腸貯藏期間亞硝酸鹽殘留量測定

灌腸貯藏期間亞硝酸鹽殘留量的變化如圖4 所示。

由于本試驗灌腸為盡可能滿足綠色食品要求，配料中未加入人工合成型抗壞血酸鹽，抗壞血酸鹽作為發色助劑，廣泛應用于腌肉制品生產，可起到降低亞硝酸鹽殘留的作用，因此對照組灌腸在貯藏0 d 時的亞硝酸鹽殘留量高達60 mg/kg～80 mg/kg，但是通過橫向對比，兩個試驗組灌腸中的亞硝酸鹽殘留量明顯低于亞硝酸鈉組的灌腸（P＜0.05），說明在亞硝酸鹽殘留量方面，添加發酵芹菜粉的灌腸比添加相同質量亞硝酸鈉的灌腸更安全。通過此試驗結果說明發色助劑在控制亞硝酸鹽殘留方面的重要性，尋找符合綠色腌肉制品要求的發色助劑也將成為一個研究方向。

圖3 WBL-45 發酵芹菜液和VBL-97 芹菜發酵液中亞硝酸鹽的變化規律Fig.3 The nitrite determination of celery juice treated by WBL-45 and VBL-97

圖4 灌腸貯藏期間亞硝酸鹽殘留量測定Fig.4 The residual nitrite determination of sausages under refrigeration

2.3 灌腸貯藏期間TBSRS值測定

灌腸貯藏期間TBARS 值變化如圖5 所示。

圖5 灌腸貯藏期間TBARS 值測定Fig.5 The TBARS determination of sausages under refrigeration

TBARS 值代表肉制品被氧化的程度，3 組灌腸TBARS 值在均呈現顯著的上升趨勢（P＜0.05），控制脂肪氧化效果最好的是 WBL-45 組（P＜0.05），其次依次為 VBL-97 組和亞硝酸鈉組，VBL-97 組在 0～5 d 內與亞硝酸鈉組不存在明顯差異（P＞0.05），第7 天控制脂肪氧化效果開始好于亞硝酸鈉組（P＜0.05），說明WBL-45 發酵芹菜粉和VBL-97 發酵芹菜粉制作的灌腸制品抗氧化性整體好于亞硝酸鈉組。

2.4 灌腸貯藏期間a*值測定

灌腸貯藏期間a*值變化如圖6 所示。

圖6 灌腸貯藏期間a*值測定Fig.6 The a*determination of sausages under refrigeration

3 組灌腸 a*值呈顯著的下降趨勢（P＜0.05），且在1 d 和5 d 時，3 組灌腸的a*值不存在明顯差異（P＞0.05），在 3 d 和 7 d 時，WBL-45 組的 a*值大于 VBL-97 組（P＜0.05），可以看出，發酵芹菜粉與亞硝酸鈉的發色作用接近，且WBL-45 發酵芹菜粉對于灌腸的發色作用要略好于VBL-97 發酵芹菜粉。

3 結論

復合菌種WBL-45 和VBL-97 在發酵天然芹菜汁過程中，均具備一定硝酸鹽還原作用，并且亞硝酸鹽產生峰值均在芹菜液pH 以及硝酸鹽含量達到最低時出現。復合菌種WBL-45 較VBL-97 硝酸鹽還原能力更強，在38 ℃發酵條件下，WBL-45 接種量為1.42×106CFU/g、發酵時間24 h 時，亞硝酸鹽峰值量可達1 013 mg/kg，VBL-97 在最佳接種量為 1.25×106CFU/g、發酵進24 h 時，亞硝酸鹽峰值量為256 mg/kg。利用兩種發酵芹菜粉制作的灌腸，a*與添加亞硝酸鈉組存在差異但相差不大，且在TBARS 值和亞硝酸鹽殘留方面優于亞硝酸鈉組，同時WBL-45 發酵芹菜粉灌腸的a*值要比VBL-97 組高，TBARS 值要低于后者，為今后替代人工合成亞硝酸鹽生產綠色腌肉制品提供了新思路。