鱗尾木中總黃酮含量測定及抗氧化活性研究

朱成豪，唐健民，韋霄，*，高麗梅，鄒蓉，秦惠珍，朱鴻杰

（1.桂林醫學院藥學院，廣西桂林541004；2.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林541006；3.柳州市園林科學研究所，廣西柳州545005）

鱗尾木 （lepionurus sylvestris BL.） 系山柚子科（Opiliaceae）鱗尾木屬灌木或常綠小喬木植物，又名山芥蘭、甜菜樹[1]，主要分布于熱帶、南亞熱帶、中亞熱帶地區，垂直分布于海拔800 m～1 700 m，混生于常綠闊葉林中。尼泊爾、錫金、印度東北部、緬甸、泰國、越南、馬來西亞和印度尼西亞等國均有分布。我國有一種，主要分布在云南東南部與廣西西南部，多見生長于河谷密林或石縫間隙中[2]，常被當地居民當作一道味道鮮美的野菜食用。經研究發現，鱗尾木中營養成分豐富[3]，粗蛋白質、維生素C、粗脂肪、粗纖維均高于常見蔬菜，并且K 含量遠遠高于Na，這種特點有助于預防高血壓和冠心病等心血管疾病[4]，具有很高的開發價值。黃酮類化合物有許多藥理作用，如：抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、免疫調節、抗心血管病[5-8]等，在食品、醫藥、保健品等領域應用廣泛。本試驗采用單因素試驗和響應面試驗對鱗尾木總黃酮的提取工藝進行了研究，通過紫外可見分光光度法[9]對廣西境地不同地區鱗尾木中的總黃酮含量進行了測定并研究了其體外抗氧化活性，從而為鱗尾木黃酮藥物及功能性食品開發奠定基礎，以期為鱗尾木這一稀有野菜的合理開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鱗尾木采自廣西壯族自治區境內的4 個不同地區，分別為龍州弄崗國家級自然保護區、隆安縣龍虎山自然保護區、南寧市隆安縣內斗村和南寧市隆安縣玉良村。

供試試劑：蘆丁標準品（批號：MUST-12040302）：中國藥品生物制品檢定所；蒸餾水、乙醇、5%亞硝酸鈉 、10 % 硝 酸 鋁 、4 % 氫 氧 化 鈉 、Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、維生素C、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH、Tris-HCL、鄰苯三酚、HCl、鄰二氮菲、PBS、FeSO4、H2O2（分析純）：桂林卓一生物有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DL-720E 智能超聲波、電子分析天平：梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制備

精密稱取真空干燥至恒重的蘆丁標準品20 mg，乙醇溶解制成0.4 mg/mL 的對照品溶液[10]。分別取制備好的對照品溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置于25 mL 容量瓶中。加50%乙醇至10 mL，加5%亞硝酸鈉1 mL，混勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，50%乙醇調至刻度，混勻，得空白液、對照品溶液；靜置15 min后在190 nm～900 nm 處進行光譜掃描，確定選用510 nm 作為測定波長。以吸光度為縱坐標，總黃酮濃度為橫坐標繪制回歸曲線，如圖1 所示，回歸方程為Y=0.203 8x-0.007 8，R2=0.999 2，總黃酮濃度在0.010 mg/mL～0.10 mg/mL 范圍內，線性關系良好。

圖1 蘆丁的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取樣品粉末 0.5 g，按照料液比為 1 ∶41.8（g/mL）加80%乙醇18.9 mL，64.6 ℃水浴提取50.7 min，超聲波頻率為35 KHz，超聲波功率為330 W，提取結束后過濾，洗滌液合并，定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.3.3 鱗尾木總黃酮提取工藝優化試驗

1.3.3.1 單因素試驗

1）超聲波功率對鱗尾木總黃酮得率的影響

準確稱取樣品粉末0.5 g，按料液比1 ∶20（g/mL）加入50%乙醇10 mL，40 ℃水浴中提取30 min，超聲波功率分別為 60、180、300、420、540 W，超聲波頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至 50 mL，按照蘆丁標曲步驟加樣，測定吸光度，計算總黃酮含量。

2）提取溫度對鱗尾木總黃酮得率的影響

準確稱取樣品粉末0.5 g，按料液比1 ∶20（g/mL）加入 50%乙醇 10 mL，分別在 40、50、60、70、80 ℃水浴中提取30 min，超聲波功率分別為420 W，超聲波頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至 50 mL，按照蘆丁標曲步驟加樣，測定吸光度，計算總黃酮含量。

3）乙醇濃度對鱗尾木總黃酮得率的影響

準確稱取樣品粉末 0.5 g，按料液比 1 ∶20（g/mL），分別加入 20%、40%、60%、80%、100%乙醇 10 mL，在60 ℃水浴中提取30 min，超聲波功率分別為420 W，超聲波頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至 50 mL，按照蘆丁標曲步驟加樣，測定吸光度，計算總黃酮含量。

4）料液比對鱗尾木總黃酮得率的影響

準確稱取樣品粉末 0.5 g，按料液比 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），分別加入 100%乙醇 10、15、20、25、30 mL。在 60 ℃水浴中提取 30 min，超聲波功率分別為420 W，超聲波頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至50 mL，按照蘆丁標曲步驟加樣，測定吸光度，計算總黃酮含量。

5）提取時間對鱗尾木總黃酮得率的影響

準確稱取樣品粉末 0.5 g，按料液比 1 ∶20（g/mL），加入100%乙醇10 mL，在60 ℃水浴中分別提取15、30、45、60、75 min，超聲波功率分別為 420 W，超聲波頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至 50 mL，按照蘆丁標曲步驟加樣，測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.3.3.2 超聲波頻率對鱗尾木總黃酮得率的影響

準確稱取 0.5 g 樣品粉末，按照料液比 1∶20（g/mL）加入50%乙醇10 mL，40 ℃水浴中提取30 min，超聲波功率為180 W，超聲波頻率分別為高頻（61 kHz）和低頻（35 kHz），過濾，定容至 50 mL。

1.3.3.3 黃酮得率的計算方法

式中[11]：C 為提取液中黃酮的含量，（mg/mL）；V 為提取液體積，mL；M 為樣品粉末質量，g。

1.3.3.4 響應面分析

采用Design Expert 8.0.6 軟件設計響應面試驗。根據Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，從單因素試驗中選取對提取結果影響比較大的4 個因素：料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間為自變量，黃酮得率為響應值，共計29 個試驗點進行組合試驗[12-15]。因素與水平見表1。

表1 因素與水平表Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.4 鱗尾木總黃酮體外抗氧化活性試驗

1.3.4.1 鱗尾木總黃酮對·OH 的清除作用

試管中加入1 mL 0.75 mol/L 鄰二氮菲，2 mL pH 7.45 PBS 溶液、1 mL 蒸餾水、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 0.01%H2O2，充分混勻后于37 ℃下恒溫水浴1 h。536 nm 處測定其吸光度Ap；用1 mL 水代替H2O2，測定其吸光度 Ab；用 1 mL 樣液代替 1 mL 水，測定其吸光度As[16]。以VC作對照。

1.3.4.2 鱗尾木總黃酮對DPPH·的清除作用

不同產地的黃酮樣液與DPPH 溶液等體積混合，30 min 后用無水乙醇作參比，在517 nm 處測定其吸光度A1，測定不同產地的樣液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A2，DPPH 溶液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A0，取3 次平行試驗結果根據下列公式計算對DPPH·的清除率[17]。以VC作對照。

1.3.4.3 鱗尾木總黃酮對O2-·的清除作用

取 5 mL 0.05 mol/L，pH=8.2 的 Tris-HCL 緩沖液25 ℃水浴預熱20 min，分別加入1 mL 樣液，0.5 mL 25 mmol/L 的鄰苯三酚，混勻后25 ℃水浴準確反應4 min，立即加入 2 滴 8 mol/L HCl 終止反應。299 nm 處測定吸光度A1，空白對照組的吸光度A0。將鄰苯三酚溶液用0.5 mL 蒸餾水代替，得到吸光度A2。取3 次平行試驗結果計算對超氧陰離子自由基的清除率。以VC作對照[18]。

1.3.4.4 總還原力的測定

1.0 mL 樣液加入2.5 mL 的1 %鐵氰化鉀溶液和2.5 mL 的0.22 mol/L 磷酸鹽緩沖液，混合均勻后于50 ℃水浴中反應30 min，迅速冷卻加入10%三氯乙酸2.5 mL，在 4 000 r/min 下離心 10 min。最后取 2.5 mL 上清液，加2.5 mL 蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min 測定700 nm 處的吸光度值[19]。以VC作對照。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度的選擇

在超聲處理中，水浴溫度對鱗尾木黃酮得率的影響見圖2。

鱗尾木中總黃酮的得率隨溫度的升高先增加后降低，在60 ℃時，所提取的鱗尾木中總黃酮得率達1.22%。繼續升高溫度，總黃酮提取率逐漸降低?？赡苁怯捎谠诟邷厍闆r下，鱗尾木樣品粉末中其他物質析出，影響了總黃酮的提??；也可能由于溫度過高使得黃酮化合物的結構被破壞，導致得率降低。按照單因素試驗條件選擇，應以60 ℃為宜。

圖2 溫度對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of different temperature on yield of flavonoid

2.1.2 乙醇濃度的選擇

乙醇濃度對鱗尾木中總黃酮的提取影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of different ethanol concentration on yield of flavonoid

由圖3 可知，隨乙醇濃度的增加，總黃酮的提取率也隨之增加。在乙醇濃度為80%的條件下，所提取的鱗尾木中總黃酮得率達到2.19%。乙醇濃度超過80%后，黃酮得率下降。黃酮一般難溶或不溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑，但乙醇濃度過高時，樣品溶液沸點降低，且醇溶性雜質開始析出，導致總黃酮得率下降。由此可知，80%乙醇對鱗尾木總黃酮的提取相對較好。

2.1.3 料液比的確定

料液比對鱗尾木總黃酮得率的影響見圖4。

由圖4 可知，隨著提取液的增加，總黃酮的提取率先增加后降低。在料液比1 ∶40（g/mL）處，所提取的鱗尾木中總黃酮得率達1.90%。繼續增加提取液后，黃酮物質得率不再增加甚至降低，且繼續增大溶劑量既浪費溶劑又不易回收，所以料液比以1 ∶40（g/mL）為宜。

2.1.4 超聲功率的選擇

超聲功率對鱗尾木總黃酮得率的影響見圖5。

圖4 料液比對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of different rate of solid to solution on yield of flavonoid

圖5 超聲功率對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic power to solution on yield of flavonoid

由圖5 可知，隨著超聲功率的增大，總黃酮的得率也相應增加。在超聲波功率達到300 W 時，所提取的鱗尾木中黃酮得率為1.36%。繼續增大超聲功率，黃酮物質提取率開始降低?？赡苡捎诔暡üβ实脑龃髮е铝它S酮的結構被破壞，所以超聲功率以300 W 為宜。

2.1.5 提取時間的確定

提取時間對鱗尾木總黃酮提取的影響見圖6。

圖6 時間對黃酮提取得率的影響Fig.6 Effect of different time on yield of flavonoid

由圖6 可知，在15 min～45 min 內鱗尾木中總黃酮的得率隨著時間的增加而增大，在45 min 處黃酮提取率達到最高值0.77%。時間繼續增加黃酮得率變化開始降低可能是因為時間太長，會使黃酮類化合物的結構遭到破壞，也可能是由于長時間提取會使鱗尾木粉末溶出其它雜質，使得總黃酮提取率降低。所以為了保證黃酮物質的提取率以及減小提取周期，以45 min為宜。

2.1.6 超聲波高低頻的選擇

超聲頻率對鱗尾木總黃酮提取率的影響見圖7。

圖7 超聲頻率對黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of different ultrasonic frequency to solution on yield of flavonoid

如圖7 所示，當超聲頻率為低頻（35 kHz）時，總黃酮的提取率要優于高頻（61 kHz），達到1.23%。所以在超聲輔助提取時選用低頻（35 kHz）即可。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 試驗結果

根據表2 設定的水平和因素，共設29 個試驗點，其中24 個為析因點，5 個為零點。得到各個試驗條件的黃酮得率，試驗結果見表3、表4。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and result

續表3 響應面試驗設計及結果Continue table 3 Response surface experimental design and result

表4 回歸模型的方法分析Table 4 The analysis of varianceof regression model

由軟件分析得到回歸方程為：Y=2.65+0.076A+0.13B+0.45C+0.29D-0.055AB+0.13AC-0.093AD-0.064BC-0.008BD-0.049CD-0.24A2-0.17B2-0.48C2-0.33D2，其中Y 為鱗尾木黃酮含量的預測值。該模型的預測復相關系數R2=0.986 3，矯正系數Adj R2=0.972 6，說明試驗的實際值和預測值擬合度比較好。由表4 可以看出，該回歸模型P<0.000 1，失擬誤差不顯著，表明該模型在統計學上是有意義的。A、B、C、D 4 個因素所模擬的一次項小于0.05，說明因變量和所選自變量之間的線性關系顯著，該回歸方程能代替試驗真實點分析試驗結果。模擬的二次項P 都小于0.01，表明A、B、C、D 4 個因素對鱗尾木黃酮的提取率都達到極其顯著的水平，交互項AC、AD 的P 值小于 0.05，達到顯著水平，由此可知，料液比與提取溫度，料液比與提取時間這些因素之間存在一定的交互作用，并且它們之間的交互作用會對鱗尾木中的總黃酮提取率產生顯著影響。

2.2.2 響應面交互作用分析

通過 Design-Expert 8.0.6 軟件，將 AC、AD 交互進行分析比較，做出響應面曲線圖，見圖8。

圖8 各個因子交互作用的響應面圖Fig.8 The response surface of interaction between every two factors

由響應面三維圖8 可知，當各因素在一定范圍內增大時，對應的響應值也增大；但當響應值達到最高點，各因素的值繼續增大時，其響應值卻不斷減小。等高線圖的中心點在3D 圖上的投影即最高點，表明該點的提取率最高。圖8 中每個響應曲面都開口向下，呈現凸面形狀。

2.2.3 優化與驗證試驗

依據以上響應面試驗模型和結果分析，得出最佳提取條件下的鱗尾木中總黃酮的提取率為2.83%，料液比 1 ∶41.8（g/mL），超聲功率 330 W，提取溫度 64.6 ℃，提取時間50.7 min。在此最佳條件下，將平行驗證試驗重復進行5 次，可得鱗尾木總黃酮的提取率的平均值2.77%。實際所測得的提取率的平均值和預測值減少0.16 %，表明該模型的可靠性較高，并且提取工藝的重復性良好，在后續試驗中可選取以上條件進行含量測定。

2.3 不同地區鱗尾木總黃酮含量比較

根據前期超聲輔助提取鱗尾木中總黃酮的條件，分別對采自不同地區的鱗尾木進行黃酮提取及含量測定。其不同地區鱗尾木的總黃酮得率如圖9 所示。

圖9 不同地區鱗尾木的黃酮提取得率Fig.9 Flavonoid extraction yield of Lepionurus sylvestris BL.in different area

由圖9 可知，來自廣西玉良天坑的鱗尾木中總黃酮物質較多，其得率達到3.67%?？赡苁怯捎谠摰貐^的適宜生態環境對鱗尾木體內各項物質造成了有利影響，對該地區的鱗尾木的開發利用有一定指導意義。

2.4 不同地區鱗尾木中總黃酮體外抗氧化活性

鱗尾木中總黃酮體外抗氧化活性見圖10。

根據圖10 能夠看出，不同地區鱗尾木中黃酮對·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，當控制黃酮濃度為1 mg/mL 左右時，不同地區的鱗尾木對·OH 和 O2-·的最大清除率分別為13.27%、30.98%，而對DPPH·的清除率又以玉良地區最高，達到38.68%。在試驗濃度的誤差范圍內，鱗尾木黃酮的還原力可達到同等濃度VC的一半以上，可見鱗尾木黃酮體外抗氧化活性較好。

圖10 鱗尾木總黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·清除率Fig.10 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of Lepionurus sylvestris BL.fructus flavonoids

3 結論

本試驗采用響應面法優化鱗尾木中黃酮的提取工藝條件，對不同地區的鱗尾木含量進行了對比，并研究了其體外抗氧化活性。最優條件為：超聲波功率（330 W），超聲頻率（35 kHz），乙醇濃度（80 %），料液比（1 ∶41.8 g/mL），提取溫度（64.6 ℃），提取時間（50.7 min），總黃酮得率2.83%。鱗尾木黃酮對·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，當控制黃酮濃度為1 mg/mL 左右時，不同地區的鱗尾木對·OH、O2-·和DPPH·的最大清除率分別為13.27%、30.98%、38.68%，并具有較好的還原能力。近年來，研究人員對于功能性天然產物的生物學活性與人類健康的關系研究越來越多，抗氧化活性物質的研究領域也從化學藥物轉變到中藥和食品上，一些蔬菜特別是綠色蔬菜的攝入可有效提高血漿中抗氧化物質的含量[20]，通過比較，作為藥食兩用的鱗尾木的抗氧化活性比一般蔬菜（馬鈴薯13.0%，蔥4.9%，獨頭蒜30.3%，蘿卜-3.1%等）要高[21]。此外，廣西玉良天坑內的鱗尾木黃酮含量及抗氧化活性均優于其他三個地區，可能是因其特有的生態環境因素引起，有待進一步考究，此試驗可為鱗尾木這一稀有野菜的進一步開發利用提供一些基礎。

采用超聲波提取法提取鱗尾木中的黃酮類化合物，所用時間短，要求溫度低，提取率好，方法簡單易行，具有明顯的優勢。