基于生物信息學分析篩選骨關節炎差異表達基因▲

何 熠 熊海風 李毅成 方德鵬 余 雪 楊 淵,

(1 廣西醫科大學附屬埌東醫院，南寧市 530021，電子郵箱：361040956@qq.com；2 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院創傷骨科，南寧市 530013，3 廣西桂林市人民醫院高壓氧科，桂林市 541000)

骨關節炎是最常見的慢性關節病之一，患者不僅長期處于疼痛狀態，還會逐漸喪失關節功能和活動性。骨關節炎是最常見的關節炎形式，隨著時間的推移，軟骨磨損加重，病情會惡化。雖然關節軟骨破裂是骨關節炎的主要特征，但其他關節組織包括滑膜和軟骨下骨，也共同參與了疾病的進展。目前尚無可以阻止骨關節炎進展并逆轉損害的藥物[1-2]。骨關節炎的主要治療目標是控制疼痛和改善關節功能。常用的治療藥物包括非甾體抗炎藥、局部給藥的皮質類固醇和黏彈性補充劑。對于許多患者而言，由于缺乏有效藥物而出現進行性軟骨損傷，最終需要手術干預。

作為關節結構的一部分，滑膜可以產生滑液，維持關節活動。在許多關節疾病中也同時存在滑膜病變，其在促進疾病的發生和發展中起作用[3]。流行病學研究表明，脛骨和股骨的軟骨損傷進展或與炎性滑膜存在一定的聯系[4-5]，而滑膜組織及其分泌的滑膜液在骨關節炎的病理發展中起重要作用[4，6]。骨關節炎的病因復雜，由多種因素共同作用，包括遺傳因素、關節損傷、肥胖和老化[7]。了解遺傳易感性的生物學機制不僅可以為研究疾病的發病機制提供新思路，而且還可以開發出能夠減緩或阻止疾病進展的新療法。近年來，高通量基因芯片在疾病的分子診斷、分類、預后評估等方面應用廣泛，這為研究骨關節炎的發病機制和分子診斷提供了新途徑[8-9]。有學者使用骨關節炎樣品和匹配的對照樣品開發了基因表達文件GSE1919，建立了人骨關節炎的分子分類；基于差異基因表達分析、亞類預測和通路分析，發現根據基因表達數據和不同預后，可將骨關節炎患者分為具有不同遺傳特征的亞組[10]。本研究對骨關節炎滑膜組織基因芯片數據(GSE1919)進行生物信息學分析，旨在更好地了解骨關節炎的分子機制，為該疾病的診斷和治療提供有價值的信息。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數據 于GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下載骨關節炎滑膜組織基因芯片數據集GSE1919，該數據集基于Affymetrix Human Genome U95A Array平臺，共包括5例骨關節炎滑膜樣本(骨關節炎組)及5例健康對照滑膜組織(對照組)。

1.2 數據預處理和差異表達基因的篩選 利用R語言的數據差異分析工具包Limma對數據進行差異分析，篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)，設置篩選閾值為P<0.05，差異倍數(fold change,FC)≥2。利用Affy工具包對基因探針與基因庫中的基因名進行匹配，如果多個探針對應同一基因名，則取其平均表達值。

1.3 功能富集分析 利用DAVID在線分析數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析，從分子功能、細胞成分和生物過程3個層面對上調的DEGs進行歸類，以進一步了解其相關功能。同時，利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數據庫(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)對上調的DEGs進行信號通路分析，以了解導致骨關節炎滑膜病變主要的信號通路，富集基因數>2、P<0.05被認為差異具有統計學意義。

1.4 蛋白互相作用網絡分析 基于STRING數據庫(https://string-db.org/)信息識別蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)，使用Cytoscape軟件3.4.0(http://www.cytoscape.org/),通過3種[包括等級(Degree)、最大集團中心性(maximal clique centrality，MCC)、最大鄰域組分(maximal neighbourhood component，MNC)]不同的算法構建3個PPI網絡。使用CytoHubba插件進行PPI網絡的拓撲分析。參數設置為無重量的網絡，結果按降序排列，包括學位中心性、中介中心性和親密度中心性， 具有前20個最高中心的節點被視為中樞基因。

2 結 果

2.1 DEGs的篩選結果 與對照組相比，在骨關節炎組中共有1 145個DEGs，包括483個上調的DEGs和662個下調的DEGs，其中上調的DEGs包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)。 DEGs的火山圖如圖1所示，熱圖如圖2所示。

圖1 GSE1919樣本集中的DEGs的火山圖 圖2 GSE1919樣本集中的DEGs的熱圖

2.2 功能富集分析結果基因本體富集分析 結果顯示，在分子功能方面，上調的DEGs主要涉及受體活性、細胞黏附分子活性；在細胞成分方面，上調的DEGs主要集中于細胞膜、細胞外成分、細胞外間隙等；在生物過程方面，上調的DEGs主要與細胞通信、信號轉導有關。見表1。KEGG通路分析結果顯示，上調的DEGs顯著富集于磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、細胞因子受體相互作用、TNF信號通路、黏著斑以及細胞黏附分子等信號通路。見表2。

表1 骨關節炎患者中上調的DEGs的基因本體富集分析結果

表2 骨關節炎患者中上調的DEGs的KEGG通路分析結果

2.3 PPI網絡分析結果 通過3種不同的算法構建了3個PPI網絡，得到了相似的結果。IL-6、IL-8、IGF、AGT在PPI網絡中顯著上調。見圖3。

圖3 骨關節炎患者中上調的DEGs的蛋白與蛋白相互作用

3 討 論

近年來，人們對骨關節炎進展所涉及的因素及機制的認識明顯提高。目前，學界認為骨關節炎不是單一的疾病，而是多種機制共同作用的最后階段，其初始階段可以由許多因素觸發和延續[11]。根據此觀點，骨關節炎可分為多種亞型，部分亞型可能出現更多的生化及炎癥反應，或表現出更多的遺傳特征，但所有這些亞型最終都會聚合到共同的表型中。然而，骨關節炎病理事件的確切順序還不清楚，其中軟骨下骨損傷、滑膜組織慢性炎癥和軟骨侵蝕之間的時間關系仍未知[12]。

本研究對來自骨關節炎患者的關節軟骨樣品和正常樣品進行了全面的微陣列芯片分析，最終篩選出483個上調的DEGs，其中包括TNF、IL-6、IL-8、IGF、AGT；DEGs主要與細胞通信、信號轉導等生物過程有關；DEGs在TNF信號通路、細胞黏附分子、絲裂原活化蛋白激酶等信號通路途徑中顯著富集。

TNF通路被認為是參與驅動炎癥級聯反應的主要通路。TNF由軟骨細胞、單核細胞、成骨細胞和滑膜組織產生，可誘導產生許多炎癥和分解代謝因子。在骨關節炎患者中，TNF水平在滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中明顯升高[13]。TNF可以通過獨立或協同作用特異性地結合兩種特定細胞膜上的受體，即TNF受體Ⅰ(p55)和TNF受體Ⅱ(orp75)。與正常細胞相比，骨關節炎軟骨細胞和滑膜成纖維細胞中p55表達增加[14]。p55可能是在關節組織細胞中負責介導TNF活性的主要受體，但兩種受體類型均被認為積極參與信號轉導，并與不同的細胞內蛋白質級聯相關[15]。因此，TNF通路激活可能在骨關節炎發生發展中起關鍵作用，可作為骨關節炎多種生物學過程的潛在治療靶點。

IL-6及IL-8是骨關節炎患者關節軟骨分泌的炎癥因子，是擾亂代謝的關鍵介質，且可增強受累關節組織的分解代謝。既往有研究表明，IL-6和IL-8的高表達是誘導炎癥組織中B細胞應答增加的重要免疫病理因素[16]。Franckhauser等[17]指出，慢性升高的IL-6及IL-8水平可能導致骨骼肌糖代謝紊亂和器官炎癥。在本研究中，IL-6和IL-8是PPI網絡中顯著上調的中樞基因。 基于上述研究結果，我們推測IL-6可能作為主要促炎細胞因子，參與骨關節炎的發生過程。

AGT是一種α-2-球蛋白，主要由肝臟產生并釋放到血液循環中，并在腎臟分泌的血管緊張素原酶作用下轉變為血管緊張素Ⅰ；隨后，其被血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)切割，生成血管緊張素Ⅱ[18]。有證據表明，腎素-血管緊張素系統的局部成分在肥大的軟骨細胞中表達，而在透明軟骨細胞中則不表達，提示該系統可能在軟骨細胞退變中發揮作用[19]。有證據表明ACE抑制劑(雷米普利)可以改善類風濕性關節炎患者的血管功能[20]。然而，很少有研究直接顯示ACE抑制劑對骨關節炎的影響。在本研究中，AGT基因在骨關節炎患者中上調，且AGT是PPI網絡中的中樞蛋白，這與既往的研究結果[8-9]相似。因此，AGT可能在骨關節炎的發生和進展中起關鍵作用，但這仍需要進一步的驗證。

IGF-1和IGF-2是控制宮內和出生后身體生長和發育的重要生長因子。Ni等[21]研究發現，通過產前乙醇暴露建立宮內發育遲緩大鼠模型，與對照組相比，產前乙醇暴露組成年后代軟骨破壞增加，骨關節炎進展加快；免疫組織化學結果顯示，IGF-1信號傳導途徑組分的表達降低，這與產前乙醇暴露組中胎兒骨骺軟骨中Ⅱ型膠原減少的變化一致。該研究表明，產前乙醇暴露可下調血液IGF-1和局部軟骨IGF-1信號水平，導致關節軟骨發育不良，增加骨關節炎易感性。但是，IGF-1和骨關節炎之間的確切關系鮮有研究報道。 在本研究中，IGF基因是PPI網絡中最重要的中樞基因,其可能在軟骨Ⅱ型膠原代謝過程中起作用。

DEGs鑒定和深入分析可能有助于確定骨關節炎發病機制中的有用靶點和途徑。IL-6、IL-8、IGF和AGT基因可能是參與骨關節炎發展的重要基因，這或可為骨關節炎治療靶點的研究提供新的見解。本研究的局限性在于篩選的基因和途徑未經實驗驗證，這可能成為未來研究的焦點。