健脾活血方含藥血清對肝癌細胞肝細胞生長因子/c-Met通路、尿激酶型纖溶酶原激活因子分泌及缺氧狀態下細胞活性及增殖的影響▲

方 禎 卜文靜 許尤琪

(南京中醫藥大學第二附屬醫院暨江蘇省第二中醫院腫瘤科，南京市 210017，電子郵箱：fssda68@163.com)

全球每年有超過50萬人罹患肝癌，其中超過50%發生在中國，患者的五年自然死亡率超過95%[1]。盡管已經有切除手術、經導管肝動脈化學栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)等治療手段，使得肝癌患者術后5年總生存率達到53%，轉移和復發仍然是肝癌患者術后病情惡化的主要原因和長期存活的主要障礙，術后五年復發率仍高達62%[2-4]。腫瘤轉移需要突破細胞外基質，而尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是重要的蛋白水解酶，能有效地降解細胞外基質[5-6]。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種可調節多種細胞生長、運動和形態發生的多功能因子，其受體c-Met過表達于多種腫瘤細胞，具有酪氨酸激酶活性，二者形成HGF/c-Met信號通路，刺激多種腫瘤細胞的增殖與運動[7-9]。越來越多的研究表明中藥健脾活血方能夠改善癌癥預后，減少復發與轉移[10-12]，其是否通過HGF/c-Met通路影響uPA的合成從而抑制癌癥的復發和轉移值得進一步探索。本研究探討健脾活血方含藥血清對缺氧狀態下肝癌細胞活性及增殖的影響，以及其抑制癌癥復發和轉移的可能分子機制，旨在為中醫改善肝癌預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)細胞活性檢測試劑盒(上海碧云天公司，產品編號：C0009)，Transwell小室(美國Corning公司，孔徑：8.0 μm)，Cell-Light EdU Apollo567試劑盒(銳博生物，貨號：C10310-1)，12孔細胞培養版(美國Corning公司，型號：Costar 3513)，人uPA酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0535)，人HGF酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0369)，兔源c-Met一抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM4116)，β-肌動蛋白一抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM0627)，增強型RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0102-100)，羊抗兔過氧化物酶標記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1056)，超敏電化學發光即用型底物(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1171)，免疫印跡試驗專用一抗二抗稀釋液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1017)，HGF與c-Met實時熒光定量PCR反轉錄引物由上海生工生物合成，TRIzol試劑(美國Thermo Fisher公司，貨號：15596026)，焦碳酸二乙酯水(上海碧云天公司，貨號：R0021)，SYBR Green qPCR Mix(上海碧云天公司，貨號：D7260)，氯化鈷(Sigma公司，貨號：C8661-25G)。R500通用型小動物麻醉機(深圳瑞沃德公司)等。

1.2 細胞培養 人肝癌細胞系SMMC-7721購自北納生物細胞庫(貨號：BNCC338089)。細胞于含10%胎牛血清(美國Gibco公司，批號：16000044)的RPMI-1640(美國Gibco公司，批號：C11875500BT)培養基中，放置于5% CO2、37℃培養箱中培養，使用含0.25%乙二胺四乙酸的胰酶消化后傳代，取對數生長期融合度約80%左右的細胞用于后續實驗。

1.3 實驗動物 SD大鼠20只(雌雄各半)購自南京中醫藥大學動物實驗中心[動物生產許可證號：SYXK(蘇)2005-0009]，6月齡，平均體重為300 g。飼養條件：相對濕度45%～65%，溫度21℃～26℃，光暗循環各12 h，且所有大鼠可自由獲取水和食物。采用隨機數字表法將大鼠分為實驗組及對照組。

1.4 健脾活血方含藥血清的制備 健脾活血方由以下中藥組成：太子參30 g，茯苓10 g，白術10 g，山藥10 g，茵陳15 g，薏苡仁30 g，莪術15 g，石打穿15 g，半枝蓮15 g，丹參15 g，苦參10 g。該方水煎后將藥液濃縮，得到生藥量為2 g/mL的藥液。給予實驗組大鼠灌胃健脾活血藥液，以成人劑量為標準，經體表面積換算得到給藥劑量，以4倍量給藥，即約18 mL/(kg·次)，2次/d，連續給藥7 d，末次給藥1 h后使用異氟烷進行氣體麻醉，無菌條件下從心臟取血，以300 r/min離心20 min分離血清，0.22 μm無菌濾器過濾后在56℃水浴鍋中滅活30 min，分裝后作為實驗組血清，置于-80℃凍存備用。對照組大鼠按以上程序以等量生理鹽水灌胃，取血清為對照組血清，凍存備用。

1.5 含藥血清的干預及相關指標的檢測 實驗過程中將SMMC-7721細胞分為實驗組及對照組進行相應的干預。

1.5.1 含藥血清對缺氧狀態下SMMC-7721細胞活性以及增殖能力的影響：分別使用MTT法與EdU試劑盒測定含藥血清對缺氧狀態下SMMC-7721細胞活性以及增殖能力的影響。(1)MTT實驗。將對數生長期的SMMC-7721細胞消化計數，用培養基調節細胞濃度至2.5×104個細胞/mL，96孔板中每孔加入200 μL細胞懸液，待細胞貼壁后分別換用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養基(血清濃度為10%)，并加入細胞培養級氯化鈷至最終濃度為150 μmol/L，以模擬TACE術后癌細胞缺氧狀態。實驗組與對照組血清各10組，每組做3個復孔。5% CO2、37℃培養72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h。隨后將培養基吸棄，每孔加入150 μL二甲基亞砜，37℃條件下振蕩10 min使結晶充分溶解，使用酶聯免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處的A值。(2)EdU實驗。將SMMC-7721細胞以同樣的密度接種于96孔板，貼壁后分別換用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養基(血清濃度為10%)，并加入氯化鈷模擬細胞缺氧狀態。實驗組與對照組血清各10組，每組做3個復孔。72 h后按照1 000 ∶1的比例在培養基中加入EdU試劑繼續培養，4 h后棄去培養基并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞，使用4%多聚甲醛固定30 min，甘氨酸溶液孵育5 min，使用0.5% TritonX-100穿透細胞。隨后每孔加入100 μL 1×Apollo避光染色30 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后使用1×Hoechst 33342反應液染細胞核30 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。通過計算實驗組或對照組視野內的增殖細胞(Apollo染色為紅色熒光，Hoechst染色為藍色熒光)數量占總細胞數量的百分比來判定細胞增殖率。

1.5.2 含藥血清對缺氧狀態下SMMC-7721細胞侵襲遷移能力的影響：使用Matrigel基質膠包被的Transwell小室測定SMMC-7721細胞的侵襲遷移能力。實驗前使用50 mg/L的Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃環境下過夜風干。取對數生長期SMMC-7721細胞消化重懸，調整密度至2×105個細胞/mL，加100 μL細胞懸液至Transwell上室。24孔板下室每孔分別加入600 μL含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養基(血清濃度為10%)，并在上室中加入氯化鈷模擬細胞缺氧狀態，37℃、5% CO2環境下培養24 h。24 h后取出小室，用棉簽將上層基質膠與未遷移的細胞擦除，磷酸緩沖鹽溶液洗滌后甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，再次用磷酸緩沖鹽溶液漂洗后，鏡下觀察SMMC-7721細胞侵襲遷移到下室的細胞數量。實驗重復3次。

1.5.3 含藥血清對SMMC-7721細胞分泌uPA的影響：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測細胞培養液上清中uPA的含量。分別使用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養基(血清濃度為10%)培養SMMC-7721細胞，實驗組與對照組血清各10個孔；72 h后取上清，離心去除沉淀后-20℃保存備用。將濃度為62.5～4 000 pg/mL的梯度濃度標準品與稀釋5倍后的細胞培養液上清液加入預包被抗人uPA抗體的96孔板中，每孔加入100 μL，37℃反應90 min，使其中的uPA與抗體結合；隨后每孔加100 μL生物素標記的抗人uPA抗體，37℃反應60 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后加入親和素-過氧化物酶復合物工作液100 μL反應30 min。最后每孔加入90 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺顯色液避光反應30 min，加100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺終止液終止反應后，使用酶標儀測定450 nm波長處的A值。

1.5.4 含藥血清對SMMC-7721細胞上清HGF水平的影響：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測細胞培養液上清中HGF的水平。細胞上清的制備同1.5.3。將濃度為125～8 000 pg/mL的梯度濃度標準品與稀釋5倍后的細胞培養液上清液加入預包被抗人HGF抗體的96孔板中，每孔加入100 μL，37℃反應90 min，使其中的HGF與抗體結合；隨后每孔加100 μL生物素標記的抗人HGF抗體，37℃反應60 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后加入親和素-過氧化物酶復合物工作液100 μL反應30 min。最后每孔加入90 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺顯色液避光反應20 min，加100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺終止液終止反應后使用酶標儀測定450 nm波長處的A值。

1.5.5 含藥血清對SMMC-7721細胞c-Met蛋白表達水平的影響：采用免疫印跡試驗檢測SMMC-7721細胞上清c-Met蛋白表達水平。分別使用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養基(血清濃度為10%)培養SMMC-7721細胞，實驗組與對照組血清各10個孔。72 h后，吸棄培養基并使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，每孔加入400 μL含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后使用細胞刮收集細胞，4℃環境下以12 000 r/min離心5 min后收集上清。以含50 ng總蛋白的溶液體積為上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后轉聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，c-Met一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗3次。等體積混合電化學發光底物中的A液與B液，每平方厘米膜使用0.1 mL工作液，室溫下孵育1～2 min。置于Tanon-5200化學發光分析系統內顯影，選用β-肌動蛋白為內參蛋白。

1.5.6 含藥血清對SMMC-7721細胞HGF與c-Met mRNA表達的影響：采用實時熒光定量PCR檢測HGF與c-Met mRNA的表達水平。分別使用含實驗組血清、對照組血清的RPMI-1640培養基(血清濃度為10%)培養SMMC-7721細胞72 h，實驗組與對照組血清各10個孔。取實驗組與對照組各約1×107個細胞，與1 mL TRIzol試劑一并加入離心管中，充分吹打，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s后靜置2 min，4℃環境下以12 000 r/min離心15 min，取上層水相。加入0.5 mL異丙醇后混勻，室溫靜置10 min，4℃下再次12 000 r/min離心10 min，棄去上清。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗滌沉淀，4℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清。沉淀自然干燥后，使用適量焦碳酸二乙酯水溶解待用。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參。HGF上游引物序列為5′-GAGAGAGGCGAGGAGAAACG-3′，下游引物序列為5′-GTGTAGCCCCAGCCGTAAAT-3′；c-Met上游引物序列為5′-ACGTACGGTGTCTCCAGCAT-3′，下游引物序列為5′-CTGGAGACACAGGATAGGAA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3′，下游引物序列為5′ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT-3′。利用引物與脫氧核糖核苷三磷酸合成cDNA后，使用QuantStudio實時熒光定量PCR系統進行實時定量PCR，反應體系為SYBR Green 1染料10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸0.5 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 32.5 μL。反應條件為93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 2 min，共40個循環。反應結束后得到目的基因/內參基因Ct值，使用2-△△Ct法對RNA水平進行相對定量。△△Ct =[待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均 Ct 值]-[對照組目的基因平均 Ct 值-對照組內參基因平均 Ct 值]。

1.6 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組SMMC-7721細胞活性以及增殖能力比較 實驗組SMMC-7721細胞的A值及細胞增殖率均低于對照組(均P<0.05)，見表1及圖1。

表1 兩組SMMC-7721細胞A值及細胞增殖率比較(x±s)

圖1 兩組SMMC-7721細胞的增殖能力

注：Apollo染料將增殖細胞的細胞核染為紅色熒光，Hoechst染料將所有細胞的細胞核染為藍色熒光，Merge為融合圖像，圖中標色標尺為50 μm。

2.2 兩組SMMC-7721細胞侵襲能力比較 實驗組SMMC-7721細胞遷移到下室的細胞數量為(147.807±24.213)個，少于對照組的(362.945±32.735)個(t=29.734，P=0.001)。

2.3 兩組細胞培養液上清HGF水平及細胞中c-Met蛋白表達水平的比較 實驗組細胞培養液上清HGF水平及細胞中c-Met蛋白表達水平均低于對照組(均P<0.05)，見表2及圖2。

表2 兩組細胞培養液上清HGF水平及細胞中c-Met蛋白表達水平比較(x±s)

圖2 兩組c-Met蛋白表達情況

2.4 兩組細胞HGF與c-Met mRNA相對表達水平比較 實驗組細胞HGF與c-Met mRNA的相對表達水平均低于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組細胞HGF與c-MetmRNA相對表達水平比較(x±s)

2.5 兩組細胞uPA分泌水平比較 實驗組上清液uPA濃度為(667.356±103.103)pg/mL，低于對照組的(1 273.467±117.207)pg/mL(t=14.139，P=0.001)。

3 討 論

原發性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率。近年來TACE術治療肝癌的短期療效已經得到普遍肯定，廣泛用于臨床。但有研究表明，TACE術后復發轉移概率較高，長期療效尚不確定[13-15]。目前，有越來越多關于癌癥的研究專注于深度挖掘中藥古方，有研究表明，健脾活血方有助于降低肝癌術后的復發轉移率[16]。因此本研究探究健脾活血方在減少肝癌術后的復發轉移中的作用，以及可能的機制。

由于肝癌TACE術后靶動脈閉塞，腫瘤組織處于缺血缺氧的環境，其生物學行為勢必發生改變[17-18]。為充分模擬這一變化，本研究首先在體外使用細胞培養級氯化鈷來誘導肝癌細胞系SMMC-7721的化學缺氧狀態[19]。MTT實驗與Edu實驗結果顯示，實驗組SMMC-7721細胞的A值及細胞增殖率均低于對照組(均P<0.05)，提示在缺氧狀態下，健脾活血方含藥血清可抑制SMMC-7721細胞的活性及增殖能力。而低活性與增殖能力的癌細胞可降低癌癥的復發率，因此健脾活血方或可降低肝癌TACE術后的復發率。此外，Transwell實驗結果顯示，實驗組侵襲遷移到下室的SMMC-7721細胞數量少于對照組(P<0.05)，這提示在缺氧狀態下，健脾活血方含藥血清可以降低SMMC-7721細胞的侵襲遷移能力。因此TACE術后應用健脾活血方或能降低肝癌術后的轉移率。

HGF/c-Met信號通路參與多種腫瘤細胞的增殖、運動。本實驗結果顯示，實驗組細胞培養液上清HGF水平及細胞中HGF mRNA表達水平、c-Met蛋白及其mRNA表達水平均低于對照組(均P<0.05)，提示在健脾活血方含藥血清的作用下，SMMC-7721細胞的HGF及其受體c-Met的表達下調，HGF/c-Met通路被抑制。前期研究已經證實，uPA主要參與細胞外基質的降解，在肝癌的復發、轉移中起到了重要作用[20]。本研究的酶聯免疫吸附試驗結果顯示，實驗組上清液uPA濃度低于對照組(P<0.05)，表明健脾活血方含藥血清可降低SMMC-7721細胞分泌uPA的水平，從而阻止SMMC-7721細胞外基質的降解，進而抑制腫瘤細胞的轉移能力。以上結果表明健脾活血方或通過抑制HGF/c-Met通路、調控細胞分泌uPA的水平，阻止肝癌的復發和轉移。

綜上所述，健脾活血方含藥血清能夠抑制缺氧狀態下肝癌細胞的活性及增殖能力。其機制或為通過抑制HGF/c-Met通路并減少肝癌細胞分泌uPA的水平，抑制肝癌細胞的侵襲與遷移。由于健脾活血方成分較為復雜，下一步研究可以更加深入地分析藥物成分及其作用，為改善肝癌患者預后提供更多理論依據。