HPLC法對不同產地骨碎補習用品柚皮苷的含量測定

朱常成　董瑞楠　金毅　劉軍鋒

【摘 要】 目的：采用HPL方法對不同品種骨碎補中的主要成分柚皮苷進行含量測定。方法：色譜柱C18（4.66mm×250mm，5μm）;流動相為乙腈-0.088%甲酸水溶液（23.3∶76.7）;流速0.9mL/min;溫度設為室溫;檢測波長283nm。結果：柚皮苷在157.5～472.5ng范圍內有良好的線性關系，且精密度、穩定性、重復性的RSD均低于2%;微波法對于藥材中的柚皮苷的提取效率更高;用提取器提取的效率偏低，但相比之下用純甲醇作溶劑效率較高些;不同來源的骨碎補的柚皮苷含量差異較大，有些品種中甚至不含柚皮苷。結論：該實驗采用的新型提取方法即閃式提取器提取法簡便穩定、重復性好，但提取效率不高，有待進行更深入的研究和改進。

【關鍵詞】 骨碎補;柚皮苷;HPLC法;閃式提取器提取;含量測定

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）14-0033-03

骨碎補是水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.的干燥根莖，為我國常用中藥。其可療傷止痛、補腎強骨，外用亦可消風祛斑;臨床上主要用于跌撲損傷、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動等，外治斑禿和白癜風等[1]。 除2015年版《中國藥典》收載的骨碎補外，歷代文獻中記載的骨碎補習用品有來源于3個科6個屬的10余種藥用植物[2]。目前從骨碎補中分離所得的化學成分主要涉及黃酮、三萜、酚酸及其的苷類等[3]，現行的藥典規定用高效液相色譜法測定其中主要成分柚皮苷的含量以控制其質量[1]。

柚皮苷的化學結構式

本課題通過對比不同文獻與藥典記載的提取方法及實驗結果，選用微波提取法和具有創新性的實驗型閃式提取器在不同實驗條件下對同一種類骨碎補進行有效成分的提取，并對提取效率進行對比;同時對五種不同品種的骨碎補通過提取器經相同條件提取其中有效成分，進行柚皮苷含量大小的比較，旨在為骨碎補藥材的開發與利用提供科學依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-Agilent 1100型高效液相色譜儀;中草藥粉碎機（FW135）;實驗型閃式提取器（JHBE-50V）;ME204E/02電子天平;KQ-5200B超聲儀;XH-100A微波催化合成/萃取儀;甲醇為色譜純（Fisher），乙腈為色譜純（Fisher），甲酸為分析純，水為二次重蒸水。

1.2 材料 柚皮苷標準品購自成都普菲德生物技術有限公司（純度≥98%）;骨碎補藥材由云南中醫藥大學提供，藥材均由云南中醫藥大學民族醫藥學院尹子麗老師鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性試驗[1-2] 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相：乙腈-0.088%甲酸水溶液（23.3∶76.7）;流速：0.9mL/min;溫度：室溫;檢測波長：283nm，理論板數按柚皮苷峰計算應不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷標準品6.3mg，用甲醇溶解并于100mL量瓶中定容，制成63.0μg/mL的柚皮苷溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 微波法[4] 選取一種骨碎補樣品（鱗軸小膜蓋），用粉碎機粉碎3次，每次10s。稱取藥材粗粉約0.50g，精密稱定，置于三口燒瓶中。根據文獻和實際操作，加入甲醇∶水=2∶1的甲醇水溶液150mL，微波協助提取70℃，保溫8min（每分鐘暫停攪拌一下以保證有效成分充分溶解），取出，冷卻至室溫，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液。

2.3.2 提取器提取法一 將骨碎補習用品用粉碎機粉碎3次，每次10s。稱取藥材粗粉約10.00g，精密稱定，于小燒杯中待用，精密加入分析純甲醇（≥99.8%）2L于提取桶，倒入先前已精密稱定的藥材粗粉，開啟提取器提取2 min，用注射器取下層清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液。

2.3.3 提取器提取法二 將骨碎補習用品用粉碎機粉碎3次，每次10s。取其中一種藥材（鱗軸小膜蓋）的粗粉約10.00g，精密稱定，于小燒杯中待用，精密加入甲醇1400mL和蒸餾水700mL于提取桶，攪拌使兩者混合均勻，再倒入先前備用的藥材粗粉，開啟機器提取2 min，用注射器取下層清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液。

比較方法2.3.2和2.3.3的提取效率大小，擇優對其他品種藥材進行提取。

2.4 線性關系考察 精密吸取柚皮苷對照品溶液2.5、3.5、5.0、7.5、10.0μL依次進樣，測定峰面積。以柚皮苷質量為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸得回歸方程為：y=1.6505×109x+62.03，R2=0.9958。結果表明柚皮苷進樣量在157.5～472.5ng范圍內有良好的線性關系。

2.5 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液（鱗軸小膜蓋）10μL，在2.1色譜條件下進行測定，測得柚皮苷峰面積RSD 0.08%（n=3），表明精密度良好。

2.6 穩定性實驗 精密吸取同一對照品溶液5μL，分別間隔0、18、24h，在2.1色譜條件下進行測定，測得柚皮苷峰面積RSD 1.00%，表明柚皮苷在24h內穩定性良好。

2.7 重復性實驗 對同一批骨碎補藥材（鱗軸小膜蓋），按2.3.3供試品溶液的制備方法平行制備3份，分別精密吸取10μL注入液相色譜儀，按2.1色譜條件進行測定并計算柚皮苷含量，RSD 1.31%（n=3），表明此法重復性良好。

2.8 樣品含量測定 取不同種類的骨碎補的樣品，按2.3確定的方法分別依法制備，分別精密吸取供試品各10μL，注入液相色譜儀，測定柚皮苷的含量。結果表明所測定的5種樣品中，柚皮苷的含量差異較大，且兩種提取方法的提取效率不同。見表1和表2。

3 討論與結論

實驗采用高效液相色譜法測定不同來源的骨碎補藥材中有效成分柚皮苷的含量大小，對五個不同品種的骨碎補用新型的方法進行測定，并選擇其中一個品種改變方法和溶劑作為對照。測定結果表明：不同產地不同品種的柚皮苷含量差異較大，同一提取方法和操作步驟所得的鱗軸小膜蓋中柚皮苷的含量最高為0.0618μg/g，中華槲蕨、石蓮姜槲蕨和團葉槲蕨中不含有柚皮苷;同種提取方法采用不同的溶劑提取也對測定結果有影響，即用提取器提取時，對于同一藥材的樣品，純甲醇作為溶劑時提得的柚皮苷含量比以66.7%的甲醇水作為溶劑提取得的柚皮苷含量高近一倍;不同的提取方式對于柚皮苷的提取效率亦有影響，根據方婧等人[4]的實驗結果和結論進行些許調整所采用的微波法提取測得的柚皮苷含量比用新式的實驗型閃式提取器提取同一批藥材所測得的柚皮苷含量高了一個數量級，為0.5663μg/g，但該含量相較于其他文獻所記載的[2，4-6]仍較低。

2015年版《中國藥典》對骨碎補的含量測定項中規定[1]按干燥品計算，含柚皮苷（C27H32O14）不得少于0.50%。按規定，本實驗所測定的不同種類的骨碎補中柚皮苷含量均不合格，分析原因可能如下：實驗創新性地采用實驗型閃式提取器進行藥材有效成分柚皮苷的分離提取，該方法目前無文獻記載，故均按照其說明書上所寫每次每種藥材均提取2min。通過對比測定所得的數據計算得的結果推測，藥材中的有效成分柚皮苷可能并沒有被完全提取出，由此導致最終測定得的柚皮苷含量較低，之后在該方面的實驗可改變提取器對藥材粉末進行提取的時間和溶劑組成進行研究。對中藥材的粉碎度大小對其中有效成分的浸出提取率亦可能有相當影響，該方面也可作為一個研究方向進行后續的深入探究。此外，配置對照品溶液時是用小燒杯先精密稱量再進行定容，但小燒杯和樣品的質量差異較大故產生的誤差也可能較大，從而影響標準曲線中峰面積相對應的濃度的大小，進而對測定結果產生影響。

按文獻記載的微波法[4]提取所得的柚皮苷含量經計算得的結果比文獻所記載的結果小了4個數量級，可能是受多方面因素影響的結果。文獻記載實驗中考察溶劑對提取效率的影響時發現50%甲醇的提取率最高，而本實驗中的溶劑是66.7%的甲醇;文獻考察提取溫度對柚皮苷提取效率的影響時發現120℃時提取率最高，而甲醇的沸點只有64.7℃，故本實驗實際操作時設置的微波溫度為70℃，可能會對提取結果產生影響;在保溫時間方面，文獻中得出的結論是柚皮苷在保留5min后即已提取完全，故選定保留時間為5min，而本實驗因為設定的提取溫度比文獻中使用的低，故相應的延長對藥材粗粉的保溫時間至8min，實驗操作者猜測該項對柚皮苷提取率的影響應較小。此外，不同種類和產地的骨碎補本身所含的柚皮苷含量可能本身就差異很大且質量參差，如中華槲蕨、石蓮姜槲蕨等甚至不含柚皮苷。同一來源品種藥材的干燥程度、取藥部位、藥材本身的質量也可能對測定結果產生影響。

在用實驗2.1項下的色譜條件前，先采用了現行的2015版藥典中規定的用于骨碎補含量測定的色譜條件下的流動相，即甲醇-醋酸-水（35∶4∶65）[1]，但結果十分不理想。進行色譜條件的穩定性和重復性實驗時，連續進標樣測得的保留時間由14.56min逐漸延長至14.67min，且24h后甚至延長至17.39min，遠比大多數文獻[2，4，5]所寫的時間要久。此外，該流動相對于柚皮苷的響應值較小，進樣量達10μL時峰高也只有23.4，比文獻記載[4，6]的小了近一個數量級;而所出標準峰的對稱因子較大，進樣量僅7.5μL時就已經高達2.43;檢測來源于同一份提取液的第二三份供試品試液時甚至僅在3min左右出現了一個雜峰，此外再無其他峰。按經驗推測，該結果可能與流動相的酸性偏大及檢測時間較長已經對液相柱造成一定壓力和損害有關。經商討最終決定更換流動相成分再進行含量測定。

按前期的實驗操作[2]中的色譜條件更換流動相為乙腈-0.088%甲酸水溶液（23.3∶76.7）后，測定結果大大改觀，峰面積的響應值與其他文獻記錄的相符，保留時間也相近，即在8min左右出標準峰，且每次所出峰的對稱因子均小于1，色譜的穩定性與重復性也較好。故本實驗最終采用乙腈-0.088%甲酸水溶液（23.3∶76.7）作為液相色譜的流動相。

由實驗結果可知，實驗型閃式提取器對骨碎補的提取率低于微波提取，可見該種方法還不能被廣泛應用于對中藥材標準的含量測定，設定的提取時間、溫度和溶劑都還有改進提升效率的空間，這需要做進一步的實驗進行探究。此外，實驗雖未完全按照藥典規定的方法對骨碎補進行含量測定，但結果仍具有一定的參考價值。首先，藥典中的各檢測方法雖為國家規定的具有法律強制效力的標準，也有其不太合理的地方，比如本實驗中的流動相按藥典規定的比例配制，所得到的實驗結果十分不理想，當然也可能與儀器性能跟不上有關。其次，藥典規定的提取方法操作較復雜，且提取時間過久，不利于質檢所進行實操;且有效成分的提取率受多方面影響，不能保證檢測時有效成分已完全提取出，質量標準控制的實行仍存在一定問題。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：256.

[2]朱常成，尹子麗.HPLC法測定骨碎補及其習用品中柚皮苷的含量[J].中國民族民間醫藥，2017，26（14）：20-21.

[3]劉玲玲，曲瑋，梁敬鈺.骨碎補化學成分和藥理作用研究進展[J].海峽藥學，2012，24（1）：4-9.

[4]方婧，楊洪軍，付梅紅，等.微波協助提取在中藥飲片含量測定中的應用（4）——微波法與藥典法測定骨碎補中柚皮苷含量比較[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（6）：75-77.

[5]李順祥，張志光，龍勉.不同產地骨碎補的柚皮苷含量考察[J].中南藥學，2003，1（2）：103-104.

[6]白俊鵬，尚振蘋，蔣曉文，等.骨碎補高效液相指紋圖譜研究及主要成分含量測定[J].國際藥學研究雜志，2015，42（3）：398-403.

（收稿日期：2019-05-15 編輯：程鵬飛）