波棱瓜子木脂素納米混懸劑的制備

劉 肖，劉 園，宋 青，沈成英，袁海龍

（空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100142）

目前，約有40%化學(xué)實體（單體化合物）存在難溶問題，在天然產(chǎn)物中更常見［1-2］，使得本來有價值的活性成分容易被拋棄或忽視，也是導(dǎo)致中藥越分越細、越分越無效的重要原因之一。納米混懸劑是采用少量表面活性劑或聚合物穩(wěn)定的“純藥物”顆粒所構(gòu)成的一種亞微米膠體分散體系［3］，可顯著增加藥物溶出和吸收，提高其生物利用度［4-5］。

波棱瓜子是葫蘆科波棱瓜子屬植物波棱瓜Herpetospermum caudigerumWall.的干燥成熟種子，為藏醫(yī)治療肝病的常用藥物之一［6-7］，具有明顯的抗乙肝病毒活性，尤其是HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率較高，臨床價值和應(yīng)用前景良好［8-9］。課題組前期從波棱瓜子中分離得到了4 種木脂素，即波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A、波棱素，但富集該類單體成分的量非常有限，常規(guī)方法制備納米混懸劑所需原料藥較多，故本實驗采用微量介質(zhì)研磨法制備。而且，前期以槲皮素、黃芩苷、葛根素、水飛薊素等為模型藥驗證該方法的可行性［10］，發(fā)現(xiàn)它能成功制備納米混懸劑，而且原料藥消耗少，工藝簡單，操作方便，為本實驗打下了良好的基礎(chǔ)，也為進一步發(fā)現(xiàn)波棱瓜子中抗乙肝病毒活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料

DF101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（北京恒豐長偉科技有限公司）；Winner 802 納米激光粒度儀（濟南微納顆粒儀器股份有限公司）；S-4800 掃描電鏡（日本日立公司）；ZRS-8G 智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；LC-20A 高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）。氧化鋯珠子（直徑0.4～0.6 mm）購于長沙華尊陶瓷材料有限公司。波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A、波棱素原料藥（自制，含有量均在85%以上）。聚維酮K30由安徽山河藥用輔料股份有限公司饋贈；十二烷基硫酸鈉購于天津市光復(fù)精細化工研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 穩(wěn)定劑溶液制備［11］稱取12.0 mg 聚維酮K30、9.0 mg 十二烷基硫酸鈉，置于50 mL EP 管中，加入30 mL 蒸餾水搖勻，作為含穩(wěn)定劑的溶液A，用于制備波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑；稱取聚維酮K30 24.0 mg、十二烷基硫酸鈉18.0 mg，置于50 mL EP 管中，加入30 mL 蒸餾水搖勻，作為為含穩(wěn)定劑的溶液B，用于制備波棱素納米混懸劑。

2.2 納米混懸劑制備 稱取波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 各6.0 mg，波棱素12.0 mg，置于10 mL西林瓶中，加入3.0 mL 穩(wěn)定劑溶液及適量磁力攪拌子、氧化鋯珠子，冰水浴中以一定速度研磨一段時間，即得。

2.3 粒徑分布、穩(wěn)定系數(shù)測定 適量納米混懸劑用蒸餾水稀釋，粒度儀測定其平均粒徑和多分散指數(shù)，重復(fù)3 次，取平均值。另取適量納米混懸劑，于1 500 r／min 轉(zhuǎn)速下離心30 min［12］，測定上層混懸液平均粒徑，重復(fù)3 次，取平均值，計算穩(wěn)定系數(shù)，公式為穩(wěn)定系數(shù)=離心后上層混懸液的平均粒徑／離心前的平均粒徑。

2.4 工藝參數(shù)優(yōu)化 固定波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑處方中藥物濃度為0.2%，穩(wěn)定劑溶液A 用量均為3.0 mL；波棱素納米混懸劑處方中藥物濃度為0.4%，穩(wěn)定劑溶液B 用量為3.0 mL。以平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)為指標(biāo)，考察研磨速度、研磨介質(zhì)用量、研磨時間對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響。

2.4.1 研磨速度 固定研磨時間1.0 h、氧化鋯珠用量3.0 mL，考察不同研磨速度，結(jié)果見表1。由表可知，隨著研磨速度增加，波棱甲素納米混懸劑平均粒徑先增加后降低，但在600、800 r／min 時差異不明顯，波棱酮、波棱素納米混懸劑均無明顯差異，波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑先降低后趨于不變；波棱甲素納米混懸劑多分散指數(shù)逐漸減小，但在600、800 r／min 時無明顯差異，波棱酮、波棱素納米混懸劑無明顯差異，波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑先減小后增加；波棱甲素、波棱素納米混懸劑穩(wěn)定系數(shù)先變大后變小，波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑逐漸增加，但在800、1 000 r／min 時波棱酮、波棱素納米混懸劑無明顯差異。綜合考慮，最終確定波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑研磨速度均為1 000 r／min，波棱素納米混懸劑為800 r／min。

表1 研磨速度對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響（±s， n=3）Tab.1 Effects of milling speed on average particle size，polydispersibility index and stability coefficient（±s， n=3）

表1 研磨速度對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響（±s， n=3）Tab.1 Effects of milling speed on average particle size，polydispersibility index and stability coefficient（±s， n=3）

注：與800 r／min 比較，?P＜0.05

2.4.2 研磨介質(zhì)用量 固定研磨時間1.0 h，波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑研磨速度均為1 000 r／min，波棱素納米混懸劑為800 r／min，考察不同研磨介質(zhì)用量，結(jié)果見表2。由表可知，隨著研磨介質(zhì)用量增加，波棱甲素納米混懸劑平均粒徑逐漸增加，波棱酮、波棱素納米混懸劑先減小后趨于不變，波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑先變大后減小，但在3.0、4.0 mL 時波棱甲素、波棱內(nèi)酯A納米混懸劑無明顯差異；波棱甲素、波棱素納米混懸劑多分散指數(shù)均無明顯差異，波棱酮納米混懸劑先變大后變小，但在4.0、5.0 mL 時無明顯差異，波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑先不變后減小。綜合考慮，最終確定波棱甲素、波棱素納米混懸劑介質(zhì)用量為4.0 mL，波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑為5.0 mL。

表2 研磨介質(zhì)用量對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響（±s， n=3）Tab.2 Effects of milling media consumption on particle size，polydispersibility index and stability coefficient（±s， n=3）

表2 研磨介質(zhì)用量對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響（±s， n=3）Tab.2 Effects of milling media consumption on particle size，polydispersibility index and stability coefficient（±s， n=3）

注：與4.0 mL 比較，?P＜0.05

2.4.3 研磨時間 固定波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑研磨速度為1 000 r／min，波棱素納米混懸劑為800 r／min；波棱甲素、波棱素納米混懸劑介質(zhì)用量為4.0 mL，波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑為5.0 mL，考察不同研磨時間，結(jié)果見表3。由表可知，隨著研磨時間延長，波棱甲素納米混懸劑平均粒徑無明顯規(guī)律，波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑逐漸減小后趨于穩(wěn)定，波棱素納米混懸劑逐漸增加；波棱甲素納米混懸劑多分散指數(shù)逐漸增加，但無明顯差異，波棱酮納米混懸劑先變大后減小，波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑無明顯規(guī)律，波棱素納米混懸劑明顯變大；波棱甲素納米混懸劑穩(wěn)定系數(shù)逐漸減小，波棱酮納米混懸劑無明顯規(guī)律，波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑先增加后趨于不變，波棱素納米混懸劑明顯減小。綜合考慮，最終確定波棱甲素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A、波棱素納米混懸劑研磨時間分別為2.0、6.0、6.0、1.0 h。

表3 研磨時間對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響（±s， n=3）Tab.3 Effects of milling time on particle size，polydispersibility index and stability coefficient（±s， n=3）

表3 研磨時間對平均粒徑、多分散指數(shù)、穩(wěn)定系數(shù)的影響（±s， n=3）Tab.3 Effects of milling time on particle size，polydispersibility index and stability coefficient（±s， n=3）

注：波棱甲素納米混懸劑與2.0 h 比較，?P＜0.05；波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑與6 h 比較，＃P＜0.05；波棱素納米混懸劑與1.0 h 比較，△P＜0.05

2.4.4 驗證試驗 按優(yōu)化參數(shù)制備3 批樣品，結(jié)果見表4。由表可知，4 種木脂素納米混懸劑指標(biāo)與篩選過程結(jié)果基本一致，表明工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗證試驗結(jié)果（±s， n=3）Tab.4 Results of verification tests（±s， n=3）

表4 驗證試驗結(jié)果（±s， n=3）Tab.4 Results of verification tests（±s， n=3）

2.5 形態(tài)觀察 取最優(yōu)參數(shù)制備的納米混懸劑適量，蒸餾水適當(dāng)稀釋后滴于錫箔紙上，常溫下自然揮干，于掃描電鏡下觀察，結(jié)果見圖1。由圖可知，波棱甲素原料藥呈不規(guī)則卷曲的片狀，大小5～50 μm，而其納米混懸劑呈均勻顆粒狀，大小約為500 nm；波棱酮原料藥呈棱角分明的塊狀，大小大多為10～50 μm，而其混懸劑呈棒狀，長度200 nm 左右；波棱內(nèi)酯A 原料藥呈不規(guī)則的球狀或塊狀，大小大多為5～50 μm，而其納米混懸劑呈棱角分明的顆粒狀，大小大多為200 nm，部分超過400 nm；波棱素原料藥呈不均勻的顆粒狀，大小約為5～40 μm，而其納米混懸劑為類球形，大小大多為200 nm 左右。由此可知，自然揮干后僅波棱甲素納米混懸劑粒徑明顯增加。

2.6 體外溶出度考察 由于課題組自制的波棱內(nèi)酯A、波棱素原料藥量較少，故未考察兩者體外溶出度。

圖1 樣品掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope images for samples

2.6.1 色譜條件［13］波棱甲素、波棱酮均采用Kromosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；前者流動相為乙腈-0.1%磷酸（23∶77），后者為乙腈-0.1%磷酸（35∶65）；檢測波長280 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.6.2 溶液制備

2.6.2.1 對照品溶液 精密稱取波棱甲素原料藥5.02 mg、波棱酮原料藥3.70 mg，無水甲醇分別制成502、370 μg／mL，即得。

2.6.2.2 供試品、陰性對照溶液 取波棱甲素、波棱酮納米混懸劑各500 μL，按溶出度測定方法操作，于30 min 取樣，過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。另取溶出介質(zhì)適量，過0.45 μm微孔濾膜，即得陰性對照溶液。

2.6.3 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性對照溶液，在“2.6.1”色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖2，可知溶出介質(zhì)不影響測定。

2.6.4 線性關(guān)系考察 取波棱甲素、波棱酮對照品溶液適量，稀釋成1.88、4.69、9.39、14.08 μg／mL，2.56、6.40、12.79、19.19 μg／mL，以峰面積（Y）對溶液質(zhì)量濃度（X）進行回歸，得方程分別為Y=10 044X-7 560.2（R2=0.999 6）、Y=8 553.1X-540.87（R2=0.999 9），分 別 在1.88～14.08、2.56～19.19 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.5 精密度試驗 精密吸取9.39 μg／mL 波棱甲素對照品溶液、12.79 μg／mL 波棱酮對照品溶液各10 μL，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定3次，測得波棱甲素、波棱酮峰面積RSD 分別為1.53%、1.37%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.6.2”項下供試品溶液適量，于0、5、10 h 在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定，測得波棱甲素、波棱酮峰面積RSD 分別為0.44%、1.53%，表明溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.7 加樣回收率試驗 取“2.6.2”項下供試品溶液適量，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，重復(fù)9 次。結(jié)果，波棱甲素、波棱酮平均加樣回收率分別為102.76%、101.23%，RSD 分別為1.88%、1.94%。

2.6.8 體外溶出度測定 參照2015 年版《中國藥典》第四部附錄釋放度測定方法。取波棱甲素納米混懸劑、波棱酮納米混懸劑、波棱甲素物理混合物混懸液（制備方法為稱取波棱甲素原料藥各1.00 mg于1.5 mL EP 管中，加入“2.1”項下穩(wěn)定劑溶液500 μL，超聲混勻。溶出試驗時，將其轉(zhuǎn)移至溶出介質(zhì)中，后者迅速清洗EP 管3 次，每次1 mL，清洗液倒入溶出杯中）、波棱酮物理混合物混懸液（制備方法同波棱甲素）各0.5 mL，以pH 7.5 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol／L 磷酸二氫鉀與0.05 mol／L 磷酸二氫鈉等量混合，1 mol／L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.5）為釋放介質(zhì)，控制轉(zhuǎn)速100 r／min、溫度（37±0.5）℃，于5、10、15、20、30、60 min 各取樣1.0 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾并稀釋，同時補充等溫等體積釋放介質(zhì)，續(xù)濾液經(jīng)HPLC 分析，計算體外累積溶出度，平行3次，結(jié)果見圖3。由圖可知，波棱甲素、波棱酮納米混懸劑10 min 內(nèi)體外累積釋放度分別達（80.59±1.59）%、（87.48±1.30）%，而波棱甲素、波棱酮物理混合物混懸液在60 min 內(nèi)僅分別為（48.47±1.52）%、（2.47±0.46）%，表明納米混懸劑能明顯提高波棱甲素、波棱酮體外釋放度。

圖3 樣品體外溶出曲線Fig.3 In vitro dissolution curves for samples

3 討論

微量介質(zhì)研磨制備納米混懸劑的裝置簡單易得，而且1 次制備僅需幾十毫克甚至幾毫克，可有效節(jié)約科研成本［14］。由于裝置體積小，研磨效率高，故部分藥物通過該方法制成納米混懸劑僅需要幾小時。此外，還可通過調(diào)整裝置體積來制備不同量的納米混懸劑，以滿足相應(yīng)需求［10］。

在3 個納米混懸劑指標(biāo)中，平均粒徑最重要，通常為200～500 nm；多分散指數(shù)可反應(yīng)納米混懸劑的粒徑分布，其值越小，表明粒徑分布越集中［3］；穩(wěn)定系數(shù)可用于初步判定納米混懸劑的穩(wěn)定性，其值越接近1，表明越穩(wěn)定［12］，在制備納米混懸劑過程中，一般遵循的重要性順序為平均粒徑＞多分散指數(shù)＞穩(wěn)定系數(shù)。本實驗發(fā)現(xiàn)，波棱素用量0.2% 時難以測定其粒徑，故確定為0.4%；隨著研磨時間延長，波棱素納米混懸劑平均粒徑和多分散指數(shù)均有所增加，而且穩(wěn)定系數(shù)逐漸減小，4.0 h 后其顏色加深，而且稍有渾濁，可能是在研磨過程中波棱素粒徑變小，與空氣接觸面積增加，同時局部產(chǎn)熱而發(fā)生氧化變質(zhì)；納米混懸劑可明顯增加波棱甲素、波棱酮溶出度，可能是兩者在微量介質(zhì)研磨的作用下被納米化，粒徑減小，比表面積增大，從而提高飽和溶解度和溶出率［3］。

綜上所述，本實驗對波棱甲素、波棱素、波棱酮、波棱內(nèi)酯A 納米混懸劑的工藝參數(shù)進行了考察，旨在探究微量介質(zhì)研磨制備波棱瓜子木脂素納米混懸劑的可行性，發(fā)現(xiàn)該方法操作簡單，穩(wěn)定可行。但如何解決研磨過程中局部產(chǎn)熱、成分被氧化、成分對光敏感而導(dǎo)致納米混懸劑穩(wěn)定性差等問題尚不明確，仍需要進一步研究。