半夏瀉心結(jié)腸靶向片的制備及其體外釋放行為

余 巧，馮白茹，申 茹，李大煒，徐英輝，祁銀德

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025）

半夏瀉心湯源自《傷寒論》，由半夏、黃芩、黃連、干姜、人參、炙甘草、大棗7 味藥材組成，可辛開苦降、散結(jié)消痞，主治寒熱錯雜之痞證。大量研究表明［1-7］，半夏瀉心湯是現(xiàn)代疾病（如慢性胃炎、胃潰瘍、慢性結(jié)腸炎、功能性消化不良，潰瘍性結(jié)腸炎等）臨床常用的基礎(chǔ)方，但存在煎煮耗時、服用麻煩、不易攜帶和長時間貯存的缺點；保留灌腸治療時，藥液又受體位因素影響而難以充分接觸所有受損腸黏膜，而且操作麻煩，患者舒適度差。因此，本實驗將半夏瀉心湯開發(fā)成結(jié)腸靶向片，不僅能避免湯劑、灌腸劑的缺點，還可直接將藥物運送到病灶部位來發(fā)揮療效，為臨床治療腸道疾病提供了新劑型。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；RE-3000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；B00Y 高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；JA3003 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；TDP-6 單沖式壓片機（吉首市中誠制藥機械廠）；BZF-50 真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；BPG-9240A鼓風(fēng)干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司）；BY300 A 小型包衣機（上海黃海藥檢儀器有限公司）；RC-6D 溶出度測試儀（天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥 黃芩苷（批號BWB50476 170421）、鹽酸小檗堿（批號BWB50137 170113）對照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，含有量≥98%）。甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物（Eudragit S100，德國Evonik Rohm GmbH 公司，批號B170105202）。半夏、黃芩、黃連、干姜、人參、炙甘草、大棗均購于北京同仁堂惠州藥店有限責(zé)任公司，經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德副教授鑒定為正品。藥用微晶纖維素（SH-CG1，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號171103）；交聯(lián)聚維酮（ISP XL，合肥巴斯夫生物科技有限公司，批號BSF180610）；滑石粉（鄭州宏升滑石制品有限公司）；鄰苯二甲酸二乙酯（上海麥克林生化科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材提取

2.1.1 煎煮法 稱取處方量（法半夏12 g、黃連3 g、黃芩9 g、干姜9 g、人參9 g、炙甘草9 g、大棗3 枚）藥材粗粉，第1 次以8 倍量純化水煎煮1 h，第2 次以6 倍量純化水煎煮1 h，濾過，合并濾液，定容至500 mL 備用。

2.1.2 浸漬法 稱取處方量藥材粗粉，加14 倍量70%乙醇浸漬72 h，濾過，濾液定容至500 mL備用。

2.1.3 回流法 稱取處方量藥材粗粉，第1 次加8 倍量70% 乙醇回流提取1 h，第2 次加6 倍量70%乙醇回流提取1 h，濾過，合并濾液，定容至500 mL 備用。

2.1.4 滲漉法 稱取處方量藥材粗粉，加2 倍量70%乙醇拌勻，潤濕，裝筒，浸漬24 h，再以12倍量70%乙醇滲漉，速度3 mL／（min·kg），滲漉液定容至500 ml，備用。

2.1.5 結(jié)果分析 將“2.1.1”～“2.1.4”項下濾液進(jìn)樣測定，按下式計算黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量；前期實驗顯示，黃芩苷提取率較高，故評分時設(shè)定其權(quán)重為0.75，而鹽酸小檗堿為0.25，計算綜合評分，結(jié)果見表1。最終，選擇滲漉法進(jìn)行提取。

表1 提取方法考察結(jié)果Tab.1 Results of extraction method investigation

2.2 正交試驗 以粉碎度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、乙醇用量（C）、滲漉速度（D）為影響因素，采用L9（34）正交表設(shè)計試驗，因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

由此可知，各因素對綜合評分都有顯著影響（P＜0.01），程度依次為A ＞B ＞D ＞C，即粉碎度、乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較大，滲漉速度次之，乙醇用量最小。最終，確定最優(yōu)提取工藝為A2B2C2D1，即藥材粉碎成粗粉后加10 倍量70% 乙醇，以2～3 mL／（min·kg）速度進(jìn)行滲漉。

然后，將處方量藥材放大10 倍，按優(yōu)化工藝進(jìn)行滲漉提取，進(jìn)行3 批驗證試驗，結(jié)果見表5，可知工藝穩(wěn)定可行。

2.3 結(jié)腸靶向片制備

2.3.1 片芯 取處方藥材粗粉（法半夏120 g、黃連30 g、黃芩90 g、干姜90 g、人參90 g、炙甘草90 g、大棗30 枚），按優(yōu)化工藝滲漉，滲漉液回收乙醇后濃縮成浸膏（相對密度1.35，黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量分別為74.18、12.55 mg／g）。取浸膏200 g，加入輔料（微晶纖維素∶淀粉=3∶1）100 g，60 ℃下干燥，粉碎，加入適量95%乙醇，14目篩濕法制粒，濕顆粒于60 ℃下干燥后用14 目篩整粒，再加入總顆粒量3%交聯(lián)聚維酮、1%微晶纖維素、1%滑石粉，壓片，片重（0.80±0.04）g，黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量分別為48.5、8.6 mg／g。

表5 驗證試驗結(jié)果（Ⅰ， n=3）Tab.5 Results of verification tests（Ⅰ， n=3）

2.3.2 包衣液 將Eudragit S100 分散于95%乙醇中形成均勻膠體溶液，加入鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉，再加95%乙醇至100 mL，攪拌混勻。將片芯置包衣鍋中（傾角45°），轉(zhuǎn)速30～35 r／min，鼓入熱風(fēng)（溫度40～50 ℃），預(yù)熱，包衣，即得。

2.4 黃芩苷含有量測定

2.4.1 色譜條件 LiChrospher C18色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1% 磷酸（47∶53）；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；體積流量0.8 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL 含1.10 mg 該成分的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 結(jié)腸靶向片除去包衣，研細(xì)，精密稱取約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入20 mL 甲醇，超聲（功率250 W、頻率30 kHz）30 min，放冷，甲醇定容于25 mL 量瓶，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液制備 取除黃芩以外的藥材制成結(jié)腸靶向片，按“2.4.3”項下方法制備，即得。

2.4.5 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測定，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品、對照品均能得到較好的分離，陰性無干擾。

圖1 黃芩苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of baicalin

2.4.6 線性關(guān)系考察 對照品溶液依次稀釋至11、22、55、110、220、550 μg／mL，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定。以黃芩苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程Y=41.887X-113.37（r=0.999 9），在11～550 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷含有量RSD 為1.40%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得黃芩苷峰面積RSD 為1.36%，表明儀器精密度良好。

2.4.9 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷含有量RSD為1.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗 取含有量已知的樣品9份，加入低、中、高3 個水平的對照品溶液，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定，測得黃芩苷平均加樣回收率分別為100.69%、101.70%、100.17%，RSD 分別為2.38%、2.45%、1.26%。

2.5 鹽酸小檗堿含有量測定

2.5.1 色譜條件 LiChrospher C18色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鉀（30∶70，磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0）；檢測波長345 nm；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL 含0.4 mg 該成分的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 同“2.4.3”項。

2.5.4 陰性樣品溶液制備 取除黃連以外的藥材制成結(jié)腸靶向片，按“2.5.3”項下方法制備，即得。

2.5.5 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.5.1”項色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測定，色譜圖見圖2。由圖可知，供試品、對照品均能得到較好的分離，陰性無干擾。

圖2 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of berberine hydrochloride

2.5.6 線性關(guān)系考察 鹽酸小檗堿對照品溶液依次稀釋至2、8、20、40、80、160 μg／mL，在“2.5.1”項色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測定。以鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得方程Y=24.428X-51.774（r=0.999 9），在2～160 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.5.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿含有量RSD 為1.44%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.5.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為1.74%，表明儀器精密度良好。

2.5.9 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿含有量RSD 為1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.10 加樣回收率試驗 取含有量已知的樣品9份，加入低、中、高3 個水平的對照品溶液，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得鹽酸小檗堿平均加樣回收率分別為102.85%、101.73%、100.90%，RSD 分別為1.17%、2.22%、2.63%。

2.6 體外釋放度評價及包衣處方篩選

2.6.1 體外釋放度 按2015 年版《中國藥典》四部0931 溶出度與釋放度測定法中第三法（即小杯法）［8］，轉(zhuǎn)速70 r／min，溫度（37±0.5）℃，溶出液體積150 mL，測定介質(zhì)和時間分別為0.1 mol／L鹽酸2 h、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液［9］4 h、pH 7.8～8.0 磷酸鹽緩沖液［9］1 h。在介質(zhì)轉(zhuǎn)換時間點將前一介質(zhì)傾出，然后加入溫度（37±0.5）℃的后一種介質(zhì)，繼續(xù)進(jìn)行釋放實驗，不同溶出介質(zhì)更換應(yīng)于5 min 內(nèi)完成［10］。每個時間點各取樣1 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，同時補充同溫同體積新鮮介質(zhì)，HPLC 法測定黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量，計算累積釋放度。

2.6.2 增塑劑用量 選擇鄰苯二甲酸二乙酯作為增塑劑，按表6 處方配制包衣液，使片芯增重8%，測定體外釋放度，結(jié)果見表7。由表可知，當(dāng)鄰苯二甲酸二乙酯用量為0.4%時（處方1），藥片在人工小腸液中4 h 后衣膜出現(xiàn)裂縫，黃芩苷、鹽酸小檗堿體外累積釋放率分別為10.1%、9.2%，泄漏較多；為0.6%、0.8%（處方2、3）時，包衣片在小腸液中衣膜完整無裂縫，藥物泄露較少。因此，選擇處方2，即鄰苯二甲酸二乙酯用量為0.6%。

表6 包衣處方Tab.6 Coating formulations

表7 增塑劑用量對各成分體外釋放度的影響（%）Tab.7 Effects of plasticizer consumption on the in vitro release rates of various constituents（%）

2.6.3 包衣增重 按表6 中的處方2 稱取適量Eudragit S100、鄰苯二甲酸二乙酯、滑石粉，制備包衣液，使片芯分別增重6%、8%、10%，測定體外釋放度，結(jié)果見表8。由表可知，在人工胃液中釋放2 h 后包衣片均無藥物釋放；包衣增重為8%時，包衣片在人工小腸液中4 h 后泄露不明顯，而在人工結(jié)腸液中1 h 后黃芩苷、鹽酸小檗堿累積釋放率明顯高于包衣增重10%，分別達(dá)到89.1%、86.4%。因此，選擇包衣增重為8%。2.6.4 驗證試驗 按“2.3”項下工藝制備3 批結(jié)腸靶向片，測定體外釋放度，結(jié)果見表9，可知樣品均具有結(jié)腸定位釋藥性能，而且基本穩(wěn)定。

表8 包衣增重對各成分體外釋放度的影響（%）Tab.8 Effects of coating weight gain on the in vitro release rates of various constituents（%）

表9 驗證試驗結(jié)果（Ⅱ， n=3，%）Tab.9 Results of verification tests（Ⅱ， n=3，%）

3 討論

本實驗采用滲漉法作為半夏瀉心結(jié)腸靶向片最佳提取工藝，并且發(fā)現(xiàn)藥材粉碎成中粉時，很容易堵塞孔隙而妨礙溶劑通過，滲漉液不能順利流出，導(dǎo)致操作困難，提取率也很低，故選擇粉碎度為粗粉。

口服結(jié)腸靶向給藥是指通過藥物傳輸系統(tǒng)口服給藥后，藥物不在上消化道釋放，而是到達(dá)人體回盲部后才開始崩解或溶出［11-13］。目前，pH 依賴型結(jié)腸包衣常用的材料為丙烯酸樹脂類，其中Eudragit S100 在pH＞7.0 時包衣層開始溶解，可達(dá)到結(jié)腸釋藥的目的，故選擇其作為包衣材料進(jìn)行結(jié)腸包衣［14-15］。

包衣液濃度、增塑劑用量、包衣增重等是達(dá)到理想包衣效果的關(guān)鍵因素，其中包衣液濃度不能太大，否則在包衣過程中容易出現(xiàn)黏連現(xiàn)象，可適當(dāng)添加滑石粉；添加增塑劑可提高包衣膜柔韌性，但其用量過大也會影響指標(biāo)成分在人工結(jié)腸液中的釋放；包衣增重過少，包衣層不能完全覆蓋片芯，導(dǎo)致藥物提前釋放，而過多時包衣層太厚，導(dǎo)致溶解緩慢，藥物難以釋放出來。

本實驗發(fā)現(xiàn)，所制備的半夏瀉心結(jié)腸靶向片在人工胃液中無釋放，人工腸液中黃芩苷、鹽酸小檗堿累積溶出度均小于5%，人工結(jié)腸液中1 h 后兩者均達(dá)85% 以上，符合結(jié)腸靶向片要求。同時，驗證試驗也印證了提取方法和包衣工藝穩(wěn)定可行，可為后期中藥新劑型研發(fā)提供理論依據(jù)。