HPLC法同時測定六味木香丸中4種成分

徐 僮，杜 歡，李 琪，王 張，張 靜，范 剛

（成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137）

六味木香丸為常用藏藥成方制劑，又名“如達柱巴”，收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》（藏藥分冊），具有止吐、止疼的功效，可用于治療“培根木布”引起的疼痛、噯氣、腹脹、嘔吐等［1］，主要由木香、巴夏嘎、余甘子、豆蔻、蓽茇、石榴子6 味藥材組成。其中，木香為君藥，氣濃香，性涼，味苦，能清煩熱，調和氣血，消積去食，可用于“培根”聚滯、煩熱［2］；余甘子、石榴子為臣藥，前者性涼、銳，能清血熱、健胃消食、生津止咳，主治培根病、消化不良癥［3］，而后者性溫，能開胃，助消化，可治療胃病、培根病、一切培龍病［4］。現代研究表明，六味木香丸具有明顯的抗炎、鎮痛、抗胃潰瘍損傷作用［5-6］，在質量控制方面，已有采用HPLC 法測定木香烴內酯、去氫木香內酯含有量的報道［7-9］，但尚未涉及其他成分。因此，本實驗建立HPLC 法同時測定六味木香丸中鞣花酸、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香內酯的含有量，以期為提高該制劑質量控制水平提供參考依據。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置二極管陣列（DAD）檢測器、自動進樣器、柱溫箱（美國Agilent 公司）；SB5200D 型超聲波清洗機（寧波新藝超聲設備有限公司）；UPLC-1-10T 型超純水機（成都優普超純水科技有限公司）；DZKW-S-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）；BSA124S 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。

六味木香丸9 批（批號20170708、20180620、20180620、20180620、20180815、20180905、20180912、20180912、20180915），主要購于西藏、青海、四川等地藏醫院和藏藥廠。木香烴內酯（批號111524-201710）、去氫木香內酯（批號111525-201711）對照品購于中國食品藥品檢定研究院；胡椒堿（批號PS010640）、鞣花酸（批號PS010827）對照品購于成都普思生物科技股份有限公司，含有量均大于98%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，20%～28% A；12～15 min，28%A；15～20 min，28%～55% A；20～35 min，55%～60%A；35～45 min，60%～65%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取去氫木香內酯、木香烴內酯、鞣花酸、胡椒堿對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇分別制成3.152、1.400、3.212、4.132 mg／mL 貯備液，各精密量取5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇制成每1 mL 分別含四者0.315 2、0.140 0、0.321 2、0.413 2 mg 的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取丸劑粉末約2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，密塞，稱定質量，水浴回流提取40 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 取缺蓽茇、木香及石榴子、余甘子的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由圖可知，陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成6 個質量濃度，在“2.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗 對照品溶液在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得鞣花酸、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積RSD 分別為1.16%、1.22%、1.21%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取同一批供試品溶液（批號20170708），于 0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鞣花酸、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香內酯峰面積RSD 分別為0.98%、0.24%、0.19%、0.21%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.9 重復性試驗 精密稱取同一批丸劑（批號20170708）粉末6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得鞣花酸、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯含有量RSD分別為1.83%、1.98%、1.96%、1.10%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批丸劑（批號20170708）粉末6 份，每份約1.0 g，按100%水平加入鞣花酸（4.794 mg／mL）、胡椒堿（3.776 6 mg／mL）、木香烴內酯（2.349 mg／mL）、去氫木香內酯（5.810 6 mg／mL）對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.11 樣品含有量測定 取各批丸劑粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 討論

3.1 指標成分篩選 木香為六味木香丸君藥，木香烴內酯、去氫木香內酯是其主要有效成分，具有明顯的抗炎、抗腫瘤、抗胃潰瘍等作用［10］；余甘子、石榴子用量較大，為臣藥，均含有沒食子酸、鞣花酸等鞣質，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性［11-12］；胡椒堿是蓽菝中主要有效成分，具有抗炎、抗氧化等作用［13］，這些藥理活性與該制劑治療慢性胃炎、胃潰瘍等疾病基本吻合。本實驗曾嘗試測定六味木香丸中沒食子酸含有量，但發現該成分極性較大，出峰時間很快，不能與其他極性較大的雜質峰分離，而且其專屬性不強，故最終選擇木香烴內酯、去氫木香內酯、鞣花酸、胡椒堿作為指標成分。

3.2 HPLC 色譜條件優化 本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%磷酸流動相，發現以乙腈-0.2% 磷酸為流動相梯度洗脫時，分離效果最佳。此外，還對色譜柱、檢測波長、柱溫等條件進行了研究，發現在WondaSil C18色譜柱、柱溫30 ℃、檢測波長210 nm 條件下各成分分離度、峰型、對稱因子最佳。

3.3 提取條件優化 本實驗考察了提取方法（回流、超聲、冷浸）、提取溶劑（70% 甲醇、50% 甲醇、甲醇、無水乙醇、純水）、提取時間（20、30、40、50 min）、溶劑用量（25、50、70 mL），發現50 mL 70%甲醇回流提取40 min 時，提取效果最佳。

3.4 含有量測定分析 9 批六味木香丸中均檢測出胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香內酯，平均含有量分別為0.19%、0.11%、0.27%；鞣花酸平均含有量為0.08%，但有2 批未檢測出，而且差異較大，可能是原藥材來源不同造成的。余甘子、石榴子中均含有鞣花酸，文獻［14-15］報道，不同產地2 種藥材中其含有量明顯不同。因此，為了控制六味木香丸質量，在收集原藥材時要注意保證余甘子、石榴子來源的穩定性。

4 結論

本實驗首次建立HPLC 法同時測定六味木香丸中鞣花酸、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香內酯的含有量，該方法簡便可行，準確性、重復性較好，可為該制劑質量控制及標準建立提供參考。