黃連解毒丸質量標準的再評價

張文文，王 姚，曾 嶸，張文靜，羅 虹，張 倩，劉 濤，?

（1.成都大學四川抗菌素工業研究所，四川 成都 610052；2.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；3.成都九芝堂金鼎藥業有限公司，四川 成都 610051）

黃連解毒丸由大黃（酒炒）、黃連（酒浸）、黃芩（酒蒸）、黃柏（酒炒）、滑石、梔子（炒）、川木通7 味藥材組成，為黃褐色水丸，是成都九芝堂金鼎藥業有限公司的獨家品種，具有瀉火、解毒、通便等功效，用于三焦積熱、口舌生瘡、目赤頭痛、便秘溲赤、心胸煩熱、熱痢泄瀉、咽痛衄血、瘡癤痔血，其質量標準收載于《國家中成藥標準匯編（中成藥地方標準上升國家標準部分 內科 脾胃分冊）》，但僅采用薄層掃描法對黃連、黃柏含有量進行測定［1］，方法重復性、準確度較低，受操作人員影響較大，難以進行有效控制。

準確度是指采用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率表示［2］。在對同時測定黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量的方法學進行考察時發現，加樣回收率遠低于限度要求，無法準確測定；對黃連解毒丸中主要成分的理化性質進行分析發現，黃連與包括黃芩、大黃在內的許多中藥共煎煮時均有沉淀物產生［3］，而且可溶于吡啶、稀酸、稀堿，微溶于冷甲醇、乙醇，不溶于水、氯仿、石油醚，在熱甲醇中能不斷溶解，冷卻后又生成沉淀［4］。但目前含黃芩、黃連、黃柏的中成藥幾乎都建立了黃芩苷和（或）鹽酸小檗堿含有量測定項，故方法學考察中應進行準確度研究，即加樣回收率試驗。

課題組前期發現，由于黃芩苷與鹽酸小檗堿生成沉淀，故兩者加樣回收率均不符合要求。基于此，本實驗以黃連解毒丸為代表，對黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量測定方法的準確度進行研究，考慮到該制劑由7 味藥材組成，再以梔子苷為指標。同時，根據中藥多組分、多靶點整體綜合作用的特點［5-7］，從全成分角度出發建立黃連解毒丸HPLC指紋圖譜，它是一種綜合的、可量化的鑒別模式，具有快速準確的特點［8］，可有效檢測和控制中藥產品的真實性、質量一致性、穩定性［9-10］，可為制定該制劑全面整體的質量控制方法提供實驗依據。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色譜儀，配置Waters 2996 型PAD 檢測器（美國Waters 公司）；FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；P230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；SQP 型電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；KQ-100E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

梔子苷（批號16052902）、黃芩苷（批號150718）、鹽酸小檗堿（批號16072302）、黃芩素（批號150307）、漢黃芩素（批號140217）、鹽酸巴馬汀（批號16060803）、鹽酸藥根堿（批號16070305）對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司。大黃（酒炒）（批號170108）、黃連（酒浸）（批號161124）、黃芩（酒蒸）（批號170302）、黃柏（酒炒）（批號161224）、梔子（炒）（批號161002）、川木通（批號161223）、滑石（批號170119）均經成都大學劉濤研究員鑒定為正品。黃連解毒丸（批號20170425、20170426、20180122、20180301、20180302、20180307、20180308、20180320、20180321、20180412，編號S1～S10）由成都九芝堂金鼎藥業有限公司提供。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量測定

2.1.1 色譜條件 Hypersil ODS-2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～32 min，8% →24% A；32～46 min，24% A；46～55 min，24% →34% A；55～63 min，34% →54% A；63～80 min，54% →68%A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長238 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 （1）精密稱取黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含兩者347.2、569.6 μg 的溶液，即得。（2）精密稱取黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品適量，甲醇制成每1 mL分別含兩者1 209.6、579 μg 的溶液，即得。（3）精密稱取黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品適量，二甲基亞砜制成每1 mL 分別含兩者378、651 μg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取丸劑適量，研細，精密稱取約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲（100 W、40 kHz）30 min，取出，冷卻至室溫，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別除去黃芩及黃連、黃柏，作為陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5 專屬性試驗 吸取“2.1.2”～“2.1.4”項下溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由圖可知，陰性樣品無干擾，方法專屬性強。

2.1.6 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液（1）1、2、3、4、5、6 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程分別為黃芩苷Y=1.00×106X-9.84×104（R2=0.999 5）、鹽酸小檗堿Y=8.34×105X-7.66×104（R2=0.999 5），分別在0.347 2～2.083 2、0.569 6～3.417 6 μg 范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取“2.1.3”項下供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得黃芩苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD 分別為1.33%、0.73%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復性試驗 取樣品（編號S2）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，平行6 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量RSD 分別為2.18%、2.56%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 穩定性試驗 取樣品（編號S2）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD 分別為1.49%、1.17%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 取樣品（編號S2）適量，研細，精密稱取約0.125 g，平行6 份，精密加入黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests for baicalin and berberine hydrochloride（n=6）

2.1.11 樣品含有量測定 取“2.1.2”項下黃芩苷對照品溶液（2）0.4 mL、鹽酸小檗堿對照品溶液（2）1.3 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾；取“2.1.2”項下黃芩苷對照品溶液（3）1.4 mL、鹽酸小檗堿對照品溶液（3）1.2 mL，置于5 mL 量瓶中，二甲基亞砜定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，平行3 份，在“2.1.1”項下色譜條件下進樣測定，結果見表2，可知在以甲醇、二甲基亞砜為溶劑配制的對照品溶液中，各成分含有量均低于理論值。

表2 黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量測定結果（n=3）Tab.2 Results of content determination of baicalin and berberine hydrochloride（n=3）

2.2 梔子苷含有量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS-2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～32 min，10% →24%A；32～42 min，24% A；42～80 min，24% →50%A；80～90 min，50% →52% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長238 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取梔子苷對照品適量，甲醇制成每1 mL 含662.0 μg 該成分的貯備液，精密稱取適量，甲醇制成每1 mL 含70.96 μg該成分的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取丸劑適量，研細，精密稱取約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲30 min，取出，冷卻至室溫，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例除去梔子，作為陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗 吸取“2.2.2”～“2.2.4”項下溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖2。由圖可知，該方法專屬性強，陰性無干擾。

圖2 梔子苷HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of geniposide

2.2.6 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y=1 002.1X-13.361（R2=0.999 5），在0.132 4～0.794 4 μg 范圍內線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得梔子苷峰面積RSD 為1.89%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取樣品（編號S2）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6 份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得梔子苷含有量RSD 為2.75%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取樣品（編號S2）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣測定，測得梔子苷峰面積RSD 為1.47%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取樣品（編號S2）適量，研細，精密稱取約0.125 g，平行6 份，精密加入梔子苷對照品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 梔子苷加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for geniposide（n=6）

2.2.11 樣品含有量測定 取10 批丸劑，每批2份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。以平均值的80%為最低限度，梔子苷含有量應不低于4.62 mg／g。

表4 梔子苷含有量測定結果（n=2）Tab.4 Results of content determination of geniposide（n=2）

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取樣品（編號S2）1 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，以梔子苷為參照峰，測得13 個色譜峰相對保留時間RSD 均小于0.63%，相對峰面積RSD 均小于2.95%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取樣品（編號S2）6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以梔子苷為參照峰，測得13 個色譜峰相對保留時間RSD 均小于0.80%，相對峰面積RSD 均小于2.65%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取樣品（編號S2）1 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以梔子苷為參照峰，測得13 個色譜峰相對保留時間RSD 均小于0.27%，相對峰面積RSD 均小于2.15%，表明溶液在12 h 內穩定性良好。

2.3.4 共有峰分析 按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，得到指紋圖譜（圖3），確定18 個共有峰，其峰面積占總數的90% 以上。以4 號峰（梔子苷）為參照峰（S），計算各色譜峰相關保留時間、相對保留峰面積，結果見表5～6，可知前者RSD 小于0.65%，后者為7.79%～26.98%，表明各批樣品中成分種類較穩定，但其含有量有較大差異。

圖3 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表5 共有峰相對保留時間Tab.5 Relative retention time of common peaks

表6 共有峰相對峰面積Tab.6 Relative peak areas of common peaks

按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液及除滑石以外其余6 味藥材溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，共確認7 個色譜峰所含成分，分別為4 號峰（梔子苷）、6 號峰（鹽酸藥根堿）、7 號峰（黃芩苷）、8 號峰（鹽酸巴馬汀）、9 號峰（鹽酸小檗堿）、14 號峰（黃芩素）、16 號峰（漢黃芩素），以及15 個特征峰來源，其中3 個不能得到歸屬，其余峰來自梔子（1、4 號峰）、大黃（12、15號峰）、黃柏（2、3、5 號峰）、黃連（6、8 號峰）、黃芩（7、11、13、14、16 號峰），而9 號峰歸屬于黃柏、黃連。見圖4。

圖4 共有峰指認Fig.4 Identification of common peaks

2.3.5 相似度評價 將10 批樣品指紋圖譜導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A 版）進行色譜峰匹配，測得相似度分別為0.995、0.990、0.996、0.998、0.997、0.998、1.000、1.000、0.998、1.000，擬規定其應大于0.900。

3 討論

文獻報道，黃連與包括黃芩、大黃在內的許多中藥共煎煮時均有沉淀物產生，而且黃連與黃芩復方煎出液中黃連生物堿、黃芩黃酮含有量下降［11-13］，沉淀物主要由黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿、黃芩苷、漢黃芩苷等組成。前期以甲醇為溶劑制備供試品溶液，發現黃芩苷平均加樣回收率為60.38%，RSD 為5.79%，而鹽酸小檗堿分別為69.25%、7.04%，遠低于限度，同時RSD 較大，不符合相關技術要求，其原因是由于對照品溶液與黃芩苷、鹽酸小檗堿發生反應，生成沉淀后被濾去，無法正確評價含黃芩與黃連、黃柏中成藥含有量測定的準確度。因此，課題組前期分別以甲醇、二甲基亞砜為溶劑配制黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品溶液，研究兩者發生沉淀反應的規律，發現其含有量均低于加入量。由此可知，測定含黃芩-黃連、黃柏配伍的中成藥中黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量時，無法保證其準確度。

10 批黃連解毒丸中梔子苷平均含有量為5.77 mg／g，按照平均值的80%為最低限度，擬規定其不低于4.62 mg／g；HPLC 指紋圖譜中標定了18 個共有峰，并將其中15 個歸屬到各藥材，明確了7 個所含的化學成分，相似度0.995～1.000，擬規定其應大于0.900。根據各共有峰的tR（RSD＜0.65%）和相對峰面積（RSD 7.79%～26.98%）可知，10 批樣品中成分種類較穩定，但含有量有明顯差異，可能是由于所用藥材質量不一，也可能是因為黃芩-黃連、黃柏共煎產生的沉淀大部分不能溶于甲醇。今后，課題組將建立一種準確的方法來測定黃連解毒丸中黃芩苷、鹽酸小檗堿含有量，并將其應用于三黃片、黃連上清片、黃連上清丸、黃連羊肝丸等制劑［14］的質量控制中。