HPLC-MS／MS法同時測定止咳平喘類中成藥中非法添加化學藥物

孫 曉 ，李 卓，荀 英，王 濤，朱群英，張亞鋒?

（1.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054；2.渭南市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 渭南 714000；3.陜西省藥品技術審核查驗中心，陜西 西安 710054）

止咳平喘類藥物在市場上占有很大的份額，而中藥制劑在治療哮喘等慢性疾病方面深受患者青睞［1］。一些不法分子在止咳平喘類中藥制劑中非法添加一些例如茶堿、醋酸潑尼松［2］、磷酸可待因［3］、鹽酸麻黃堿［4］、地西泮［5］等化學藥物來增加療效，達到立竿見影的效果，從而誘導消費者購買，獲取巨額利潤，表面上對短期治療起到了速效作用，實際上患者在不知情的情況下攝入未知化學藥物，導致藥物依賴性增強，嚴重的可能對身體健康造成傷害，進一步導致藥害事件［6-7］。因此，嚴格控制中成藥的非法添加，讓患者明明白白用藥尤為重要。

因中成藥成分比較復雜，不法分子非法添加化學物質(zhì)的手段也越來越高明［8］，質(zhì)檢分析工作者往往要同時運用多種分析手段才能對違禁化學成分進行定性及定量檢測［9］。止咳平喘類中成藥中非法添加的化學成分包括中樞性鎮(zhèn)咳藥（如磷酸可待因）、外周性鎮(zhèn)咳藥（如那可定）、祛痰藥（如鹽酸氨溴索）、腎上腺素受體激動藥（如沙丁胺醇）、平喘藥（如茶堿）、糖皮質(zhì)激素類（如氫化可的松）、抗生素類（如磺胺甲噁唑）［10］、鎮(zhèn)靜催眠藥（如地西泮）、過敏藥（如馬來酸氯苯那敏）等［11］，種類繁多，其中磷酸可待因、那可定等屬于管控麻醉藥品，獲取難度大；鹽酸妥洛特羅、愈創(chuàng)甘油醚等副作用明顯，結(jié)合多年的監(jiān)督檢驗工作經(jīng)驗，本研究選擇在化學藥品流通中數(shù)量較多、價格便宜、療效明確、獲取容易的13 種化學藥物作為首選目標，建立了HPLC-MS／MS 法同時測定止咳平喘類中成藥中非法添加化學藥物，以期為打擊醫(yī)藥行業(yè)存在的上述現(xiàn)象提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1200-6410B 高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-700VDB 雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Q-POD 制水機（美國密理博公司）；ME204E 電子天平、MS105 電子天平［萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。甲醇、乙腈為色譜純；水為實驗室自制一級水；其他試劑均為分析純。樣品來源為西安市轄區(qū)內(nèi)監(jiān)督抽樣，具體見表1。

表1 對照品信息Tab.1 Information of standard substances

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［12-14］資生堂（Shiseido）MGⅢC18柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，10%A；3～6 min，10%～90%A；6～10.5 min，90%A；10.5～11 min，90%～10%A；11～15 min，10%A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜參數(shù) 電噴霧離子源正模式掃描；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量10 L／min；毛細管電壓3 000 V。參數(shù)見表2［15-16］。

表2 質(zhì)譜信息Tab.2 Information of mass spectrometry

2.3 對照品溶液制備 分別精密稱定茶堿、磺胺甲噁唑、甲氧芐啶、馬來酸氯苯那敏、鹽酸苯海拉明、鹽酸氨溴索、枸櫞酸噴托維林、硫酸特布他林、沙丁胺醇、地西泮、鹽酸克倫特羅、異丙喘寧、鹽酸麻黃堿5 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，從中精密移取鹽酸苯海拉明、沙丁胺醇0.1 mL，甲氧芐啶、馬來酸氯苯那敏、硫酸特布他林、地西泮、鹽酸克侖特羅、鹽酸麻黃堿0.2 mL，茶堿、枸櫞酸噴托維林1 mL，磺胺甲噁唑、鹽酸氨溴索、異丙喘寧2 mL 置于50 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液制備 適量樣品研細混勻，精密稱取0.3 g 于50 mL 離心管中，精密移取甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再次稱定質(zhì)量，甲醇補足減失質(zhì)量，放冷至室溫后用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL，加水2 mL 混合，即得。如濃度過高，可用甲醇∶水（1∶2）稀釋至適宜濃度。

2.5 專屬性考察 取對照品溶液適量，甲醇-水（1∶2）稀釋，另取陰性供試品，按“2.4”項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣，發(fā)現(xiàn)陰性無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

圖1 各成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.6 線性關系考察 精密吸取“2.3”項下對照品溶液適量，甲醇-水（1∶2）稀釋定容，制成標準工作曲線溶液，在“2.2”“2.3”項條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，結(jié)果見表3，表明各組分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

2.7 檢出限與定量限 精密吸取“2.3”項下對照品溶液適量，甲醇-水（1∶2）稀釋定容，制成對照品溶液，在“2.2”“2.3”項條件下進樣測定，以信噪比3∶1 作為檢出限，10∶1 作為定量限。結(jié)果見表3。

2.8 精密度試驗 精密吸取對照品溶液5 μL，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6 次，記錄色譜峰保留時間、色譜圖峰面積。結(jié)果，茶堿、磺胺甲噁唑、甲氧芐啶、馬來酸氯苯那敏、鹽酸苯海拉明、鹽酸氨溴索、枸櫞酸噴托維林、硫酸特布他林、沙丁胺醇、地西泮、鹽酸克侖特羅、異丙喘寧、鹽酸麻黃堿保留時間RSD≤1.14%，色譜峰峰面積RSD≤4.64%，表明儀器精密度良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的樣品（陰性樣品）9 份，隨機分為3 組，每組3 份，加入對照品溶液適量，制成高、中、低質(zhì)量濃度加樣回收樣品，按“2.4”項下方法處理，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表4。

2.10 樣品含有量測定 按“2.4”項下方法處理待測樣品，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，計算色譜離子峰保留時間，色譜離子峰豐度比，判斷是否檢出，再代入回歸方程計算各組分含有量。結(jié)果，隨機抽取的10 批樣品中有3 批檢出非法添加，表明不但要加大監(jiān)管力度，而且要擴寬中成藥非法添加的監(jiān)管范圍，具體見表5。

表3 各成分線性關系、檢出限、定量限Tab.3 Linear relationships，detection limits and quantitative limits of various constituents

表4 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑選擇 精密稱取陽性樣品0.3 g，置于4 個同規(guī)格離心管中，精密移取甲醇、乙腈、甲醇-水（1∶2）、乙醇各15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再次稱定質(zhì)量，相應溶劑補足減失質(zhì)量，放冷至室溫后用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果，溶劑為甲醇的樣品響應優(yōu)于其他溶劑，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 溶劑效應消除 對照品分別用甲醇、甲醇-水（1∶1）、甲醇-水（1∶2）稀釋并進樣測定，發(fā)現(xiàn)溶劑為甲醇時部分組分的色譜峰會有前沿峰或拖尾現(xiàn)象，為甲醇-水（1∶1）時峰形得到改善，為甲醇-水（1∶2）時峰形最好，因此選擇其作為稀釋溶劑。

表5 各成分含有量測定結(jié)果（mg／kg）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／kg）

3.3 應用價值與創(chuàng)新 止咳平喘類中成藥非法添加化學藥物的情況時有發(fā)生，而且日益趨向高科技化。不法分子利用國家藥品標準的漏洞，不斷變換新的非法添加成分以逃避監(jiān)督檢驗，這種違法行為不僅危害了患者的健康，還嚴重阻礙了中醫(yī)藥事業(yè)的健康發(fā)展。為此，課題組將理論知識和實際經(jīng)驗相結(jié)合，不斷擴充完善現(xiàn)有檢測成分和方法，以期建立更全面的數(shù)據(jù)資料庫。

在上述背景和實驗基礎上，本研究最終建立了一套簡單、快速、準確的HPLC-MS／MS 檢測方法，主要有以下創(chuàng)新之處：針對性強，專注止咳平喘類非法添加檢測；測定組分多，在不損失儀器靈敏度的前提下檢測類別廣；前處理簡單快速；方法經(jīng)反復驗證準確可靠。該方法為打擊藥品非法添加現(xiàn)象注入了新源泉，可推廣應用于日常監(jiān)督管理，進而最大限度保障群眾用藥安全，并促進中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)繁榮進步。