舒心通脈顆粒提取工藝的優化

周 泉，王晗雪，李素麗，張慧倩，李國文，程雪梅，陳 穎?，王長虹?

（1.上海市中西醫結合醫院，上海 200082；2.上海中醫藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海市復方中藥重點實驗室，上海中藥標準化研究中心，上海 201203）

舒心通脈方是臨床用于治療慢性心衰達數十年之久的院內制劑，由炮附子、干姜、白術、黃芪、蒲黃5 味藥材組成［1］，取附子辛熱之性，溫補心腎之陽，通行血脈；輔以干姜，以溫通全身陽氣；益以白術、黃芪、蒲黃，化瘀而不傷正，諸藥相伍，以達舒心通脈、益氣活血之效。本方臨床應用時劑型為水煎劑，存在使用不便等缺點，故有必要在傳統湯劑的基礎上研制成顆粒劑、片劑或膠囊劑等固體劑型，以便于臨床使用。

提取工藝試驗設計方法主要有均勻設計、正交試驗設計，但均存在精度不夠、模型預測性較差等缺點，而且取值僅僅是接近最佳取值，無法精確到最佳點，不能靈敏地考察各因素之間的交互作用等缺陷［2］。鑒于此，近年來常用集數學和統計學方法于一體的星點設計-響應面法進行設計，具有試驗次數少、精度高等特點，在藥學領域廣泛應用［3］，并且大多采用多指標評價體系權重賦分的方法［4］，它分為主觀賦權法和客觀賦權法［5］，前者中G1 法是對層次分析法（AHP）進行改進的主觀賦權法，具有計算速度快、無需一致性檢驗等優點［6］，而后者中熵權法可與其他方法組合使用［7］，從而優選出合理可行的提取工藝參數。因此，本實驗采用星點設計-響應面法結合G1-熵權法優化舒心通脈顆粒提取工藝，為該制劑臨床應用提供參考。

1 材料

Waters e2695 HPLC 色譜儀（配置四元泵、Waters 2998紫外檢測器、柱溫箱，美國Waters 公司）；EYELAN-3000旋轉蒸發儀（日本Rikakikai 公司）；BSA124S-CW 電子分析天平（萬分之一）、BT25S 電子分析天平（十萬分之一）［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；ZNHW 電熱套（上海羌強儀器設備有限公司）。毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號130030-201801，含有量98%）、香蒲新苷（批號240012-201805，含有量98%）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（批號250069-201801，含有量98%）對照品均購于上海鴻永生物科技有限公司；6-姜辣素對照品（批號Y11J9H65403，含有量98%）購于上海源葉生物科技有限公司。炮附子、干姜、白術、黃芪、蒲黃飲片均購于上海康橋中藥飲片公司，經上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員鑒定為正品。甲醇、磷酸為色譜純（美國Fisher 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 含有量測定

2.1.1 色譜條件 BostonC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.5% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，35% A；15～22 min，35%～45% A；22～45 min，45%～95% A）；檢測波長254 nm（0～30 min）、280 nm（30～45 min）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.2 供試品溶液液制備 按處方量精密稱取炮附子（黑順片）適量，加5 倍量水，先煎1.5 h，其余4 味藥材加入上述藥液，再加5 倍量水煎煮45 min，合并，濃縮至密度為1.01 g／mL，精密量取適量，濃縮4 倍，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，70%甲醇制成每1 mL 分別含毛蕊異黃酮葡萄糖苷95.0 μg、香蒲新苷94.6 μg、異鼠李素-3-O-新橙皮苷85.0 μg、6-姜辣素93.2 μg 的溶液，即得。

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.3”項下對照品溶液，稀釋后搖勻，在“2.1.1”項色譜條件下進樣20 μL 測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行回歸，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素方程分別為Y=63 270X+19 036（r=0.999 9）、Y=29 920X+805.66（r=1）、Y=35 150X-1 764.3（r=0.999 9）、Y=11 006X+3 967（r=0.999 9），分別 在0.475～95.0、2.37～94.6、2.13～85.0、4.66～93.2 μg／mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 取高（66.5、66.2、59.5、65.2 μg／mL）、中（47.5、47.3、42.5、46.6 μg／mL）、低（28.5、28.4、25.5、28.0 μg／mL）質量濃度對照品溶液，同1 d 內在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素峰面積RSD 分別為高（0.11%、0.49%、0.42%、0.09%）、中（0.36%、0.28%、0.58%、1.53%）、低（0.34%、0.64%、0.44%、0.39%），表明儀器日內精密度良好；連續測定3 d，測得各成分峰面積RSD 分別為高（0.67%、0.79%、0.85%、0.94%）、中（0.60%、0.38%、1.03%、1.64%）、低（0.39%、0.57%、1.56%、0.76%），表明儀器日間精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 精密量取供試品貯備液100 mL，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素含有量RSD 分別為1.31%、0.86%、1.02%、1.92%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素峰面積RSD 分別1.14%、1.02%、0.67%、0.30%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取“2.1.2”項下含有量已知的供試品溶液20 mL，置于50 mL 量瓶中，加入50%、100%、150%水平的對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素平均加樣回收率分別為97.29%、99.80%、96.65%、101.52%，RSD分別為1.01%、1.80%、1.15%、1.79%。

2.2 評價指標組合賦權

2.2.1 G1 法主觀賦權［6］。步驟1：確定各指標順序關系，設同級評價指標為｛x1，x2，…，xm｝，確定順序關系。步驟2：設xk-1與xk的重要程度之比的相對重要程度記為rk，且（k=m，m-1，…，2）。步驟3：計算權重系數公式為、wk-1=rkwk（k=m，m-1，……，2）。

2.2.2 熵權法客觀賦權 步驟1：原始數據矩陣歸一化，設m個評價指標、n個評價對象的原始數據矩陣為X=（xij）n×m，對其歸一化后得到屬性矩陣R=（rij）n×m，對效益型屬性（指屬性值愈大愈好的指標）而言，進行歸一化［9］，公式為rij=（xij -xmin）／（xjmax-xjmin），其中xij為第i個評價對象的第j項指標數據，xjmax、xjmin分別為xij的最大值、最小值，i=1，2，…，n；j=1，2，…，m。步驟2：求取指標熵值［10］，公 式 為，k=1／lnn，當fij=0 時，xijlnn=0。步驟3：計算指標信息權重［10］，公式為。

2.2.3 組合權重確定 設定由G1 法得到的主觀權重為w1，熵權法得到的客觀權重為w2，組合權重wj計算公式為。依據復方“君臣佐使”配伍原則及功效相關藥效物質，由G1 法確定4 個評價指標重要性依次為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含有量＞干浸膏質量＞6-姜辣素含有量=香蒲新苷+異鼠李素3-O-新橙皮苷含有量，權重評價標度分別為r2=1.8、r3=1.4、r4=1.0，求得主觀權重值w1，再采用熵權法計算各指標客觀權重值w2，然后計算組合權重值w和綜合評分，最后進行直觀分析和方差分析，具體權重見表1。

2.3 星點設計-響應面法優化 選擇加水量（A）、提取時間（B）作為影響因素，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、6-姜辣素、香蒲新苷+異鼠李素-3-O-新橙皮苷含有量及浸膏得率作為影響指標，每個因素設5 個水平，用-α、-1、0、1、α 來表示（α=1.414），因素水平見表2，結果見表3，方差分析見表4。

表1 提取工藝評價指標權重值

表2 因素水平

表3 試驗設計及結果

表4 方差分析

然后，通過Design-Expert 8.0.6 軟件得到多元線性方程Y1=43.990 67+3.640 34A+0.137 38B（r=0.794 2，P=0.006 9 ＜0.05）、二項式回歸方程Y2=-91.674 48+22.946 59A+2.070 35B-0.047 417AB-0.858 62A2-0.016 209B2（r=0.924 5，P=0.007 6＜0.05），可知后者相關系數較大，擬合效果較好，可用于分析預測。由表4 可知，各因素影響程度依次為A＞B，A 有顯著性影響（P＜0.01），響應面分析見圖2。由此確定，最優提取工藝為加水量12.17 倍，煎煮時間45.67 min，預測評分94.81，考慮到實際生產需要，將其修正為加水量12 倍，煎煮時間45 min。

圖2 各因素響應面圖

2.4 提取次數考察 固定加水量為12 倍，提取時間為45 min，分別提取1、2、3 次，進行綜合評分，結果見表5。由表可知，提取2 次時已達到3 次的84%，故從資源成本、生產情況角度考慮，選擇2 次作為提取次數。

表5 提取次數考察結果

2.5 驗證試驗 按照優化工藝［炮附子加6 倍量水先煎1.5 h，其余4 味藥材（干姜、白術、黃芪、蒲黃）倒進上述藥液，加6 倍量水煎煮45 min，濾過，藥渣加12 倍量水煎煮45 min，濾過，合并濾液，濃縮至密度為1.01 g／mL］進行3 批驗證試驗，結果見表6，可知工藝合理可行，重復性、預測性良好。

表6 驗證試驗結果（n=3）

3 討論

2015 年版《中國藥典》中明確記載，附子味辛、甘，大熱，有毒，用量3～15 g，需先煎、久煎。文獻［11-16］報道，附子中雙酯型生物堿毒性極大，容易導致人體中毒，但在加熱過程中會轉化成單酯型生物堿，從而降低毒性，故本實驗采用炮附子（即藥典收錄品種黑順片）。藥典規定，附片中含雙酯型生物堿以新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿總量計，不得超過0.010%，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總量不得少于0.010%。在工藝考察中，由于水煎液無法濃縮與藥典規定一致的質量濃度，低于檢測限，無法將其納入工藝考察指標內，故未改變其先煎時間，仍按照原工藝先煎1.5 h。

本實驗選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素含有量作為指標成分，與2015年版《中國藥典》一致，而且它們轉移到水煎液中時可達到量質傳遞過程的監控，同時還對黃芪中毛蕊異黃酮進行了指認，但其含有量較低，對工藝優化影響不大，故未納入考察指標中。然后，以上述4 個成分含有量及浸膏得率為評價指標，通過星點設計-響應面法結合G1-熵權法對舒心通脈顆粒提取工藝進行優化，發現與原工藝相比，最優工藝在未降低提取效率的前提下用水量減半，既提高了生產效率，又產生了節約資源、保護環境的社會效益。由此可知，該方法科學合理，真實可靠，優化工藝參數穩定可控，有效成分得率較高，可為舒心通脈顆粒工業化生產提供實驗依據。