玉屏風對果蠅抗衰老和激活BJ 細胞端粒酶活性的作用

朱曉奕 ，洪 慶 ，朱銳靈，李 艷，姚 逸，許志文，涂升輝，湯 建，3?

（1.江蘇大學附屬醫院，江蘇 鎮江 212001；2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013；3.亳州學院中藥學院，安徽 亳州 236800）

玉屏風系中醫扶正固本的經典名方，由黃芪、白術和防風組成，藥簡效宏，臨床療效顯著。君藥黃芪補氣升陽，固表止汗；臣藥白術健脾益氣，助黃芪以固表；佐藥防風散風解痙以達邪，諸藥合參，組方嚴謹［1］。以此三味藥組方的玉屏風是健脾補腎經典方，玉屏風能通過健脾而運化水谷精微，讓腎中之精氣充盛，腦髓亦得以充養。根據傳統中醫的“補腎填精益髓”理論，玉屏風存在基于健脾益腎、生精補髓機制的抗衰老和防治神經退行性疾病的潛力［1-2］。

果蠅生命周期短、飼養簡單，與人類具有相似的病理結構，致病基因高度同源。近年來，果蠅被廣泛應用于抗衰老的相關研究中［3-4］。端粒酶是端粒復制所必需的一種特殊的DNA 聚合酶，若激活端粒酶，就可以增加細胞分裂次數，從而延長壽命。通過清除氧化應激和神經炎癥以及激活端粒酶等手段，延長端粒長度或延緩端?？s短的速度，有可能對防治老年性癡呆癥具有重要意義［5-7］。

因此，本研究以自然衰老型黑腹果蠅為模式生物，考察玉屏風對果蠅半數死亡時間、平均壽命、壽命延長率、體內氧化水平等指標的調節作用，以及對BJ 細胞端粒酶的激活作用，為玉屏風在臨床新適應癥的運用提供實驗依據。

1 材料

基本培養基（青島海博生物技術有限公司）每250 g培養基含瓊脂粉8.2 g、玉米粉108.5 g、蔗糖81.5 g、酵母粉9.2 g、苯甲酸鈉1.3 g。黑腹果蠅Drosophila melanogaster購自南京農業大學動物科技學院，于25 ℃、相對濕度60%～70% 條件下培養。BJ 人成纖維細胞（ATCC）由江蘇大學附屬醫院提供，37 ℃、5% CO2條件下培養。CAT、SOD 和MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。玉屏風膠囊（黃芪、炒白術和防風按3∶1∶1 比例配伍，批號160307）內容物由江蘇吉貝爾藥業股份有限公司提供。TRAPEZE? 端粒酶試劑盒購自美國Millipore 公司。

2 方法

2.1 培養基配制 基本培養基：20.87 g 培養基加熱溶于100 mL 雙蒸水中，稍冷后加入0.65 mL 丙酸，攪拌均勻后分裝備用。含玉屏風培養基：將玉屏風膠囊內容物溶解到雙蒸水中，稀釋后加到基礎培養基中，配制成含內容物0.3%、1%的培養基，攪拌均勻后分裝備用。

2.2 果蠅生存率的測定 參照文獻［8］，收集48 h 羽化黑腹果蠅成蟲，雌雄分開，取90 只隨機分為對照組、0.3%玉屏風膠囊組、1% 玉屏風膠囊組。每組果蠅雌雄各15 只，每組10 管，對照組喂食基本培養基，0.3%玉屏風組、1%玉屏風組分別喂食含玉屏風膠囊內容物0.3%、1%的培養基，自然光照周期，每24 h 于同一時間記錄果蠅死亡數，每96 h 更換新鮮培養基。實驗記錄至受試果蠅全部死亡，統計各組果蠅半數死亡時間、平均壽命、壽命延長率。統計時，排除意外人為因素造成的死亡或丟失果蠅數量。

2.3 檢測果蠅體內SOD、CAT 和MDA 水平 在給藥后第30 天，將果蠅放入離心管，加入9 倍果蠅體質量的生理鹽水制成組織勻漿（IKA Basic S25 勻漿機）；6 000 r／min 離心10 min，取上清液備用。參照SOD、CAT 和MDA 檢測試劑盒操作說明，測定玉屏風對果蠅體內總SOD 酶、CAT 以及MDA 的影響

2.4 檢測BJ 細胞存活率 參照文獻 ［9］，BJ 細胞用MEMα 培養基（含10% 胎牛血清、1 mmol／L 丙酮酸鈉、1.5 g／L 碳酸氫鈉）培養。待細胞生長到20～27 培養代數時接種于12 孔板中，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養36 h，加入玉屏風膠囊內容物，質量濃度分別為0.01、0.1、1.0、10、100 μg／mL，空白組加入0.1% DMSO，復孔。繼續孵育36 h 后，用MTT 法測定其吸光度。

2.5 評價BJ 細胞端粒酶活性 采用TRAP 實驗，參照文獻［7］。BJ 細胞（30～35 細胞培養代數）接種于12 孔板中，加入玉屏風膠囊內容物，質量濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μg／mL，37 ℃下5% CO2孵箱培養，每24 h 更換一半含藥物的培養基。細胞增至75%時收集細胞，離心除去培養液，PBS 洗滌，Chaps 裂解，離心，取上清液，參照TRAPEZE? 端粒酶試劑盒操作說明，凝膠在Storm? 成像系統中掃描，利用ImageQuant TL 軟件計算玉屏風對端粒酶激活的影響，空白組為0.1%二甲基亞砜（DMSO）。

2.6 統計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 玉屏風膠囊對果蠅半數死亡時間和平均壽命的影響由表1、圖1 可知，玉屏風膠囊明顯延長了果蠅的生存期限，特別是對雌性果蠅的作用更為明顯。0.3%玉屏風膠囊組果蠅的半數死亡時間為60 d（雌）、57 d（雄），1%玉屏風膠囊組為61 d（雌）、56 d（雄），遠遠長于對照組的46 d；0.3%玉屏風膠囊組平均延壽率為22.9%（雌）、20.7%（雄），1% 玉屏風膠囊組為30.8%（雌）、25.3%（雄）。

表1 玉屏風對果蠅壽命的延長作用（±s， n=15）

表1 玉屏風對果蠅壽命的延長作用（±s， n=15）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

圖1 果蠅生存曲線圖

3.2 玉屏風膠囊對果蠅SOD、CAT、MDA 水平的影響 由圖2 可知，與對照組比較，1%玉屏風膠囊明顯提高了果蠅體內抗氧化酶SOD 和CAT 水平（P＜0.05，P＜0.01），而體內的脂質過氧化產物MDA 水平明顯下降（P＜0.05）（圖2）；0.3%玉屏風膠囊對雌性果蠅CAT 水平，以及雄性果蠅MDA 水平無顯著作用，能明顯提高雄雌果蠅SOD 水平（P＜0.01）。

圖2 玉屏風對果蠅SOD、CAT、MDA 水平的影響

3.3 玉屏風膠囊對BJ 細胞生長的影響 由圖3 可知，與對照組（0 μg／mL）比較，當BJ 細胞培養到22 代時，玉屏風膠囊對BJ 細胞存活率無顯著影響；當BJ 細胞培養到27代時，玉屏風（0.1、1、10、100 μg／mL）能顯著提高BJ 細胞的存活率（P＜0.05），分別為102.7%、112.0%、114.0%、114.4%。

圖3 玉屏風對BJ 成纖維細胞生長的影響

3.4 玉屏風膠囊對BJ 細胞端粒酶激活的影響 如圖4 所示，玉屏風膠囊在0.01～1.0 μg／mL 下具有顯著的激活端粒酶作用（P＜0.05，P＜0.01），端粒酶相對活性較對照組（0 μg／mL）分別增加14.9%，42.3%和43.4%；但在較高質量濃度下（10、100 μg／mL）反而呈現抑制作用，分別降低11.4%和16.0%。上述結果表明，玉屏風在合適的濃度范圍內具有基于端粒酶機制的抗神經細胞衰老和防治衰老及與衰老相關的疾病的潛力。

在BJ 人成纖維衰老型細胞（＞30 細胞培養代數）中，玉屏風具有良好的延緩BJ 細胞衰老的作用，在0.01～1.0 μg／mL質量濃度下，端粒酶相對活性顯著增加，說明玉屏風對于衰老的細胞具有一定的逆轉作用，在臨床上具有一定抗衰老的潛力。

4 討論

衰老是人類生命過程中的必然規律，會導致腦部的神經元的數目逐漸減少，甚至產生老年性癡呆癥等與衰老密切相關的神經退行性疾病。衰老是整個機體、多個方面的功能退化，這正與中醫藥的作用特點相契合，深入挖掘傳統補益中藥，并將傳統抗衰老理論與現代醫藥學測試手段有機結合，將有助于找到理想的抗衰老方法［10］。

圖4 玉屏風激活對BJ 細胞中端粒酶活性的影響

玉屏風具有調節人體免疫力的功效，有中成藥中的“丙種球蛋白”美稱，現代臨床在內、外、婦、兒等各科疾病中得到廣泛的應用［1-2］?，F代藥理學研究表明玉屏風對機體的免疫功能具有雙向調節作用。玉屏風可促進體內免疫球蛋白A（IgA）升高；玉屏風及其總多糖能夠對抗環磷酰胺引起的小鼠巨噬細胞（M?）吞噬功能抑制，逆轉免疫低下的狀態［11］；玉屏風對環磷酰胺引起的免疫抑制狀態的小鼠脾淋巴細胞增殖具有促進作用［11-13］。低溫條件會致使小鼠樹突細胞表面分子表達降低，玉屏風能有效增強樹突細胞功能，逆轉表面分子表達降低的狀態［14］。玉屏風能夠顯著增強機體的免疫功能，這可能是其發揮“扶正、益氣固表、防邪入侵”的藥理基礎。另一方面，玉屏風具有抗炎和免疫抑制的作用，玉屏風對LPS 誘導的RAW264.7 細胞中過高的IL-β1、IL-6 和TNF-α 水平及其mRNA 的表達具有抑制作用；玉屏風多糖能夠抑制佐劑性關節炎大鼠的足腫脹，改善佐劑性關節炎大鼠低下的外周血淋巴細胞刀豆蛋白A（ConA）誘導的增殖反應，過高的淋巴細胞CD4+數量和CD4+／CD8+比例明顯下降。玉屏風多糖也能糾正佐劑性關節炎大鼠輔助性T 細胞（Th）1／Th2 平衡的Th1 偏移，改善外周血T 淋巴細胞亞群［15］。

玉屏風優良的雙向調節功能，在臨床疾病的預防與治療，以及抗疲勞、抗衰老等方面均具有良好的應用前景。深入考察玉屏風的藥理活性和作用機制，對于挖掘傳統中藥的臨床新用途（如抗衰老）具有重要意義。

玉屏風膠囊可以延長果蠅壽命，提高果蠅體內SOD 和CAT 的水平，降低脂質過氧化物的降解產物MDA 的水平，表明玉屏風膠囊有較好的抗氧化應激能力。但當玉屏風組濃度提高到3%時，第30 天總SOD 活性較同時間的空白組減少（P＜0.05），即高劑量藥物組對SOD 酶活力有一定的抑制作用。通過預實驗可知玉屏風的抗衰老作用有一定的劑量范圍，藥物濃度應控制在0.3%～1% 范圍內。BJ 人成纖維細胞是一種快速衰老的細胞，經常用來作為一種篩選用的細胞模型，評價抗衰老化合物的活性［9］。玉屏風對BJ細胞生長的具有一定的促進作用，對衰老的BJ 細胞具有一定的逆轉作用。

綜上所述，玉屏風具有良好的激活端粒酶和抗體內氧化應激能力，在抗衰老和防治老年癡呆癥方面具有良好的應用潛力。