穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的網絡藥理學作用機制

李 建，冷錦紅

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

痛性糖尿病周圍神經病變是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，主要累及感覺神經和運動神經，產生感覺及運動障礙。3%～25%的糖尿病患者會經歷這種神經病理性疼痛，表現為肢體的疼痛、麻木，嚴重者會形成潰瘍或壞疽，最終選擇截肢，嚴重地影響了患者的生活質量［1］。由于其發病機制尚未闡明，現有的治療只能緩解癥狀，而尚未有有效的治療方法來逆轉痛性糖尿病周圍神經病變的進展。

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipppnicaMak.的干燥根，具有祛風除濕、舒筋活絡、活血止痛等功效，在治療腰腿疼痛、筋骨麻木、風寒濕痹、跌打損傷等疾病有明顯療效。現代藥理研究表明，穿山龍有抗炎鎮痛、調節免疫、抗腫瘤、降血脂、鎮咳平喘等多種藥理作用。有關穿山龍單品或提取物治療痛性糖尿病周圍神經病變的研究近年來多見報道［2-3］，但其藥效物質基礎和作用機制尚不明確。本研究從網絡藥理學［4］出發，從系統生物學和網絡生物學的角度在分子網絡調控的層面，通過對穿山龍藥效成分進行計算機虛擬篩選，構建穿山龍活性成分-靶點-信號通路相互作用網絡，認識中藥穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變多成分、多靶點、多途徑的整體作用機制。以期揭示穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的藥效基礎，為更好的開發治療痛性糖尿病周圍神經病變藥物提供參考依據。

1 方法

1.1 分析平臺 網絡藥理學實驗研究的主要材料是分析軟件和數據庫，本研究中采用的數據庫和分析軟件主要有中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php，Version：2.3）、TCM Database＠taiwan 數據庫（http：//tcm.cmu.edu.tw／）、Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、Molinspiration 網站（http：//www.molinspiration.com／cgi-bin／properties）、PharmMapper 服務器（http：//59.78.98.102／pharmmapper／index.php）、UniProt 數據庫（http：//www.uniprot.org／）、Genecards 數據庫（http：//www.genecards.org／）、String 10.5 數據庫（https：//string-db.org／cgi／input.pl）、DAVID 6.8 數據（https：//david.ncifcrf.gov／home.jsp）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數據庫（http：//www.genome.jp／kegg／）、CTD 數據庫（http：//ctdbase.org／）、Cytoscape 3.5.1 軟件。

1.2 化學成分的獲得 以“穿山龍、穿龍薯蕷”為關鍵字，分別檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）和臺灣中醫藥資料（TCM Database＠taiwan），并參考國內外文獻，對穿山龍的化學成分信息進行收集。將收集的化學成分逐一輸入至Pubchem 數據庫，下載這些成分的分子結構圖，以?.mol 的格式存儲。

1.3 類藥性分析 Lipinski 類藥性五規則是藥物分子設計和藥物篩選的常用規則之一，可以比較準確地預測藥物中化合物的吸收或滲透性能，使藥物開發者能夠盡早準確地篩選出有效藥物成分，降低藥物開發成本。將上述已獲得的化合物在Molinspiration 網站中預測其吸收性質。之后依據LR［5］原則，對數據庫分析出的穿山龍化學成分進行篩選：（1）相對分子量（MW）≤500；（2）氫鍵供體（與O 和N連接的氫原子數nOHNH）≤5；（3）氫鍵受體（O 和N 的數量，nON）≤10；（4）脂水分配系數（miLogP）≤4.15。滿足上述至少2 種條件的化合物為口服活性藥物。若數據庫中化合物不符LR 原則但已有相關報道明確為穿山龍活性成分的化合物予以納入。

1.4 靶點的預測與篩選 PharmMapper 數據庫采用“反向藥效團匹配方法”，以活性小分子為探針、搜尋潛在藥物靶標、進而預測化合物生物活性［6］。因此，登陸Pharm-Mapper 數據庫上傳穿山龍活性成分的?.mol 格式文件，將“Maximum Generated Conformations”值設為300，“Select Targets Set”設 為 Human Protein Targets Only（v2010，2241），“Number of Reserved Matched Targets（Max 1，000）”設為300，收集排名前100 的靶點。由于檢索到的藥物靶點存在命名不規范等問題，因此，本研究使用UniProt 數據庫中UniProtKB 搜索功能，通過輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱，經上述數據庫檢索和轉化操作，獲取與活性成分相關的蛋白信息，去除重復靶點后，同時獲取這些靶點相應的基因名稱。利用Genecards 數據庫以“Painful diabetic peripheral neuropathy”為關鍵詞，檢索已報道的與痛性糖尿病周圍神經病變相關的基因，與上述PharmMapper 數據庫返回的靶點進行匹配，作為穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的潛在作用靶點。

1.5 靶點通路注釋分析 通過DAVID 6.8 數據庫對獲得的靶點蛋白進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析，藥物靶點富集的信號通路被認為是藥物作用的重要通路。在CTD 數據庫上以“Painful diabetic peripheral neuropathy”“diabetic neuropathy”為關鍵詞檢索痛性糖尿病周圍神經病變相關信號通路，將得到的通路與上述通路進行匹配分析，作為穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的潛在通路。

1.6 蛋白相互作用網絡構建與分析 為了闡明靶點蛋白在系統水平上的作用，本研究將穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的靶點蛋白導入String 10.5 數據庫中，限定物種為人，通過參數設置將評分條件設定為＞0.90，以保證信息的高置信度，獲取蛋白相互作用關系，結果保存成TSV格式，并將文件中的node1、node2 和combined score 信息導入到Cytoscape 軟件繪制相互作用網路，將節點大小和顏色設置用于反映Degree 的大小，邊的粗細設置用于反映Combine score 的大小，導出可視化圖形進行研究分析。

1.7 構建“活性成分-靶標-通路”網絡圖 將27 個活性成分的預測靶點結果和通路分析，在Excel 表中分別構建“活性成分-靶點”“靶點-通路”之間的相互關系，然后將其導入到Cytoscape3.5.1 軟件中建立“活性成分-靶點-通路”網絡關系圖。圖中以活性成分、靶點蛋白和通路為3類節點（node），它們之間有相互關系的分別用邊（edge）相連，節點的Degree 越大，則節點的大小越大，圖中三角形節點代表活性成分，圓形節點代表靶點，菱形節點代表信號通路，經Cytoscape 3.5.1 軟件處理，得到穿山龍相關靶點通路預測圖。在此基礎上，通過網絡分析，探究其治療痛性糖尿病周圍神經病變的機制。

2 結果

2.1 穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的活性成分篩選 通過Database＠taiwan 數據庫、TCMSP、Pubchem 和文獻檢索［7-8］的方式，收集到45 種化學成分，對其進行類藥性分析，以進一步獲得活性成分。此外，穿山龍中薯蕷皂苷、纖細皂苷雖不符合LR 原則，但已有研究［7］表明這兩種化合物為穿山龍中含有量較高的活性成分，故均予納入研究，因此共得到活性成分27 種。為方便后續研究，將它們分別編號為D1～D45，其中D1～D27 為穿山龍的潛在活性成分。詳見表1。

2.2 穿山龍的主要活性成分靶點預測結果 通過Pharm-Mapper 服務器反向分子對接實驗，預測出了27 種活性成分的作用靶點為316 個。通過與GeneCards 數據庫搜索到的靶點進行匹配，篩選出穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變靶點129 個。其中，化合物diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）對應的潛在靶點最多，達到57個，提示了化合物D12、D23、D25 可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的潛在有效成分。

2.3 GO 生物過程分析 通過對穿山龍活性成分作用靶點GO 富 集 分 析，結果 表 明，在 生 物 學 過 程（biological process）方面（圖1），主要參與信號轉導、蛋白水解、氧化還原、對缺氧的反應、蛋白質磷酸化、MAPK 級聯等生物過程；在細胞組分（cellular component）方面（圖2），主要存在于細胞質、核、質膜、線粒體等細胞組分當中；在分子功能（molecular function）方面（圖3），主要參與蛋白質結合、鋅離子結合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性等分子功能。

2.4 KEGG 代謝通路分析 將穿山龍129 個治療痛性糖尿病周圍神經病變的靶點導入到DAVID 6.8 數據庫中進行通路分析，取P＜0.05 的通路，通過KEGG、CTD 數據庫及文獻挖掘等方式，對計算出的通路進行綜合分析。結果共富集到90 條信號通路，其中與痛性糖尿病周圍神經病變密切相關的有33 條（表2），涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信號通路。富集結果表明，大多數基因顯著富集到PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway 這3 條信號通路上，表明這些通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的關鍵通路。

表1 45 個化合物信息

圖1 穿山龍主要活性成分的生物過程（BP）富集分析

圖2 穿山龍主要活性成分的細胞成分（CC）富集分析

圖3 穿山龍主要活性成分的分子功能（MF）富集分析

2.5 PPI 網絡的構建與分析 為了更好地理解穿山龍的作用機制，基于PPI 關系，利用String 10.5 數據庫獲取穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的靶點蛋白之間相互作用的關系，并導入到Cytoscape 3.5.1 軟件中繪制相互作用網絡，見圖4。節點的大小和顏色表示Degree 值的大小，節點大小越大，顏色由橙色變藍色對應的Degree 值越大；邊的粗細表示Combine score，邊越粗Combine score 值越大。PPI 網絡包含129 個蛋白質節點，290 條相互作用關系（連線），平均Degree 為4.8，其中節點表示靶點蛋白，每條邊表示靶點蛋白之間的作用關系。根據節點的Degree 繪制出Degree 排名前15 的Hub 蛋白質節點的條形圖（圖5）。包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基α（PIK3R1）、GTPase HRas（HRAS）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸蛋白激酶JAK2（JAK2）、胰島素樣生長因子I（IGF1）、白細胞介素-2（IL-2）等。穿山龍靶點蛋白PPI 網絡圖顯示，這些靶點是網絡的樞紐節點，是穿山龍抗痛性糖尿病周圍神經病變的核心靶點。

表2 KEGG 代謝通路

圖4 穿山龍靶蛋白PPI 網絡

圖5 各蛋白信息

2.6 穿山龍活性成分-靶點-通路網絡構建 使用Cytoscape 3.5.1 軟件構建穿山龍活性成分-靶點-信號通路網絡圖。直觀地呈現了27 個活性成分、129 個靶蛋白、33 條作用通路和痛性糖尿病周圍神經病變疾病間的關聯（圖6）。由此可見，穿山龍主要活性成分的作用靶點分布于不同的通路，相互協調、共同調節藥物治療痛性糖尿病周圍神經病變的作用機制。從穿山龍活性成分-靶點-通路網絡圖中可知，穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的作用機制與代謝紊亂、血管損害、氧化應激的損傷、炎癥反應、自身免疫的損傷等多種發病學說均有相關性，可從不同角度揭示穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的作用機制。

圖6 化合物-靶點-信號通路網絡圖

3 討論

目前，痛性糖尿病周圍神經病變的發病機制尚未完全明確，研究認為痛性糖尿病周圍神經病變的發病機制與代謝紊亂、血管損害、神經營養因子、氧化應激的損傷、炎癥反應、自身免疫的損傷、遺傳因素、神經元細胞膜離子通道功能障礙、蛋白激酶C（PKC）、致痛因子等因素相關。因此，痛性糖尿病周圍神經病變的治療主要通過控制血糖、營養神經、改善循環、改善代謝、抗氧化應激、抗炎鎮痛等方式改善癥狀［9］。

穿山龍中的薯蕷皂苷元與薯蕷皂苷均為已報道的具有抗痛性糖尿病周圍神經病變作用的活性成分。本實驗前期研究已表明［3］，中藥穿山龍提取物薯蕷皂苷（D2）可明顯減少糖尿病大鼠血清致痛物質HA 和5-HT 的表達，療效強于強的松。已有研究［2］表明，薯蕷皂苷元（D1）可改善STZ 誘導的糖尿病大鼠氧化應激和炎癥水平以及抗氧化能力，增加機械痛閾和熱痛閾值并降低疼痛。網絡分析結果顯示，化合物D1、D2 連接的靶點分子數目較多分別是54、44，因此，這兩種活性成分是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的關鍵成分。除此之外，未見其他化學成分有治療痛性糖尿病周圍神經病變的報道。本研究對獲取的27 種具有相關生物活性的化學成分進行分析，發現diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）等對應的痛性糖尿病周圍神經病變相關靶點個數最多，說明該成分可能是穿山龍發揮抗痛性糖尿病周圍神經病變作用的重要成分，為進一步篩選其有效成分提供了理論依據。

蛋白質與蛋白質相互作用的網絡顯示，排名前15 的Hub 蛋白包括SRC、PIK3R1、STAT1、MAPK1、JAK2、IGF-1、IL-2 等。據報道，Src 激酶可通過調節TRPV1 通道，從而緩解STZ 誘導的糖尿病小鼠機械性異常性疼痛［10］。Mauvais-Jarvis［11］研究發現，PI3-激酶在胰島素的代謝作用中起著核心作用，通過雜合破壞PIK3R1 基因可降低p85α，AS53 和p50α 的水平提高胰島素敏感性，降低空腹和餐后血糖水平，并顯著降低與遺傳性胰島素抵抗相關的糖尿病發病率；Chu 等［12］研究發現，系統性胰島素樣生長因子-1（IGF-1）治療可逆轉糖尿病周圍神經病變小鼠的痛覺過敏現象并改善其活動能力，文獻證明這些基因大都涉及炎癥、氧化應激和胰島素信號調節等環節，它們參與了痛性糖尿病周圍神經病變基本病理生理過程。

穿山龍的靶點GO 富集分析結果表明穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變涉及信號轉導、蛋白水解、氧化還原、對缺氧的反應、蛋白質磷酸化、MAPK 級聯等生物過程，涉及細胞質、核、質膜、線粒體等細胞組分，涉及蛋白質結合、鋅離子結合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性等分子功能，是一個復雜的過程。KEGG 通路分析顯示，穿山龍可能通過調節PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、VEGF 信號通路、PPAR 信號通路、TLRS 信號通路、JAK／STAT 信號通路等信號傳導通路來調節血糖、抗氧化應激、抗炎鎮痛從而發揮治療痛性糖尿病周圍神經病變的作用。

PI3K-Akt 信號通路存在機體內多種細胞中，對細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種生物過程起重要的調節作用。已有研究表明［13］，持續抑制PI3K／Akt 信號通路可緩解糖尿病神經病理痛的癥狀并改善其神經功能。此外，PI3K-Akt 信號傳導通路的阻滯是外周組織胰島素抵抗及2型糖尿病發生的最基本機制之一［14］。在KEGG 分析中，PI3K-Akt 信號通路是富集基因最多的信號通路，因此，推測穿山龍可通過抑制PI3K-Akt 信號通路，減輕疼痛癥狀的同時改善胰島素抵抗，這為痛性糖尿病周圍神經病變的治療提供新方向，有望通過調控PI3K／Akt 信號通路來預防其發生。

MAPK 信號通路包括細胞外信號調節激酶1／2（ERK1／2），c-Jun 氨 基（N）-末 端 激 酶 1／2／3（JNK1／2／3），p38MAPK 和ERK5 四條途徑［15］。MAPK 信號通路與腫瘤、炎癥、氧化應激密切相關［16-17］。王超等［18］研究發現，通心絡膠囊能夠降低糖尿病周圍神經病變小鼠氧化應激損失，改善坐骨神經中SOD、MDA、p-p38MAPK 的表達，同時能夠提高痛閾值和神經傳導速度；Sweitzer 等［19］研究發現，p38αMAPK 抑制劑SD-282 可改善STZ 誘導的糖尿病大鼠的機械性異常性疼痛、熱痛覺過敏及福爾馬林誘導的炎性疼痛，因此，通過干預MAPK 信號通路對糖尿病周圍神經病變具有一定的保護作用。在KEGG 分析中，MAPK 信號通路是富集基因較多的信號通路，因此推測MAPK 通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的關鍵通路。

血管內皮生長因子（VEGF）是血管生成的主要介質，VEGF 在糖尿病微血管并發癥的發病機制中起重要作用。Di等［20］發現VEGF-B 可以減輕糖尿病小鼠感覺神經元中過量分泌的ROS，提示VEGF-B 的神經保護作用可能通過激活糖尿病感覺神經元的抗氧化防御實現；Li 等［21］研究發現，紅花提取物和乙酰谷酰胺（SA）注射液能減輕糖尿病周圍神經病變引起的神經損傷，其保護作用可能與促進VEGFB，NGF 和GDNF 的表達有關。VEGF-B 不僅可以保護中樞神經，還可以促進周圍神經的損傷修復。在KEGG 分析中，VEGF 信號通路是富集基因較多，因此，調節VEGF 信號通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的關鍵通路之一。

Toll 樣受體（TLRs）是涉及先天免疫和病原體識別的天然免疫受體。TLR 通過募集銜接蛋白活化核因子-κB（NF-κB）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、干擾素（IFN）調節因子，來激動多個信號傳導途經，以調節細胞因子，趨化因子和干擾素在炎癥中的表達，在固有免疫系統中起著重要作用［22-23］。Yan 等［24］在鏈脲佐菌素誘導的痛覺過敏糖尿病大鼠中發現TLR4 mRNA 表達上調，此外，TLR4 表達與機械刺激的爪壓撤回閾值和對熱刺激的爪縮回潛伏期有關。TLR4 信號通路的兩種下游促炎細胞因子TNF-α 和IL-1β 的蛋白水平也顯著升高，并與糖尿病大鼠的機械／熱超敏反應相關。最近有研究顯示［25］，薯蕷皂苷可通過調節TLR4 ／MyD88 介導的氧化應激和炎癥，對脂多糖誘導的急性肺損傷起保護作用。因此，筆者推測Toll 樣受體信號通路可能是穿山龍發揮抗炎作用一條通路。

JAK-STAT 信號通路是近年發現的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫和炎癥等許多重要的生物學過程［26］。最近有報道稱，JAK／STAT 通路失調導致肥胖和糖尿病的發生［27］。Ma 等［28］發現抗氧化劑如白藜蘆醇可通過抑制JAK／STAT 信號通路來抑制小鼠巨噬細胞中的炎癥通路；Liu 等［29］在STZ 誘導的糖尿病心肌纖維化大鼠中發現硫化氫（H2S）可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，其機制可能與下調JAK ／STAT 信號通路有關，從而抑制氧化應激和ER 應激，炎癥反應和細胞凋亡。因此，JAK ／STAT 信號通路可能是穿山龍發揮抗炎、抗氧化應激的一條潛在通路。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是參與多種生理過程的配體激活轉錄因子，在諸如葡萄糖和脂質代謝，能量平衡，細胞增殖，炎癥，免疫和腫瘤等方面均有著舉足輕重的作用。PPARs 由PPARα、PPARβ 和PPARγ 3 種亞型組成［30］，其中PPARγ 是PPAR 通路最為重要的靶點，PPARγ 具有抗炎和抗氧化應激的作用［31］。目前，PPARs 激動劑已經廣泛應用于糖尿病、脂質紊亂、代謝綜合征等疾病的臨床治療。說明了穿山龍可能通過作用于PPARγ 蛋白調控PPAR 通路來調節血糖、改善炎癥和氧化應激。此外，KEGG 分析顯示穿山龍還可通過INSR、MAPK1 等靶點與胰島素信號通路、AMPK 信號通路來控制糖脂代謝的正常運行。

痛性糖尿病周圍神經病變在中醫學中屬于“消渴痹癥”范疇，消渴日久，損傷氣陰，氣血運行不暢致瘀血阻滯絡脈，絡脈淤閉，不通則痛，因此，“血瘀”和“絡損”是消渴痹癥的基本病機之一。中藥穿山龍具有活血通絡止痛之功效，對于“絡脈瘀阻”所致的該疾病具有良好療效。張蘭教授［32］認為除微血管和微循環之外，神經組織在形態和功能上與中醫的“絡脈”也很類似，并將其歸屬“絡脈”范疇；現代醫學認為，痛性糖尿病周圍神經病變的發病主要受兩方面因素影響，即血液供應受損的血管因素和神經元或神經纖維內部因高血糖導致病理生理改變的代謝因素［33］，這與中醫“血瘀絡損”的病機觀有一定相似性。本研究根據網絡藥理學方法，預測了穿山龍活血通絡止痛的治療機制可能通過調節血糖，改善氧化應激水平，減輕神經血管損傷，抑制炎癥反應，從而緩解糖尿病神經病理性疼痛。

綜上所說，本研究基于網絡藥理學研究方法，通過靶點預測、類藥性分析、GO 基因富集分析和KEGG 通路注釋分析技術構建了穿山龍靶點蛋白相互作用網絡和活性成分-靶點-信號通路網絡，從系統層面研究了穿山龍活性成分治療痛性糖尿病周圍神經病變多成分-多靶點-多信號通路的作用機制。從理論預測、整體分析角度，闡明了穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的潛在作用機制，為未來驗證穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經病變的作用機制提供了思路與線索。