黃精皂苷對糖尿病腎病大鼠腎損傷的保護作用及Wnt／β-catenin 信號通路的影響

彭 靜

（樂山職業技術學院，四川 樂山 614000）

糖尿病腎病為糖尿病常見的并發癥之一，是導致糖尿病患者終末期腎衰竭及死亡的主要原因，對人類健康造成嚴重危害［1］。迄今為止，糖尿病腎病的發病機制并未闡明，現有研究數據表明，血液動力學因素、糖代謝紊亂、遺傳因素、組織缺氧及炎性細胞浸潤等均能引起糖尿病腎病［2］。目前，控制血壓及血糖是預防糖尿病腎病發生及惡化的主要手段，但是效果難以讓人滿意［3］。黃精別名雞頭黃精、黃雞菜，為傳統中藥，是百合科植物多花黃精和黃精的根莖，具有益腎、健脾、潤肺、補氣、養陰等功效［4］。研究表明，黃精具有降血糖、減少腎損傷、抗氧化、調血脂、抗衰老、抗骨質疏松等藥理作用［5］。黃精皂苷為黃精的主要生物活性成分，黃精皂苷可以通過提高慢性應激大鼠免疫功能或調節5-HT／β-arrestin2／akt 信號通路發揮抗抑郁作用，但其對糖尿病腎病的研究報道較少［6-7］。在本研究中，采用鏈脲佐菌素誘導法建立糖尿病腎病大鼠模型，通過檢測黃精皂苷干預下的大鼠一般狀態、腎重指數、尿素氮及血肌酐、24 h 尿蛋白定量、腎臟組織病理形態變化、Ⅳ型膠原Wnt4、β-catenin 表達等指標，探討黃精皂苷對糖尿病腎病大鼠腎損傷是否具有保護作用及潛在機制，以期為黃精皂苷的臨床應用提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 動物 Wistar 大鼠70 只，清潔級，雄性，體質量200～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2006-0009。

1.2 試藥 黃精皂苷（批號20170215，含有量86.7%，成都普瑞法科技開發有限公司）；厄貝沙坦片（批號170422，杭州賽諾菲制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司）。兔抗大鼠Ⅳ型膠原、Wnt4、β-鏈蛋白（βcatenin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 One Touch Ⅱ型血糖儀及配套試紙（美國強生公司）；RM 2135 輪轉型切片機（德國Leica 公司）；600 型全自動生化分析儀及IX71 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；DYCZ-24KF 型垂直電泳儀、DYCZ-40 K 型轉印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 Wistar 大鼠60 只，喂養7 d 適應環境，禁食12 h 后采用單次腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素（55 mg／kg）建立糖尿病腎病大鼠模型；72 h 后監測血糖值，當血糖＞16.7 mmol／L 時視為建模成功。將建模成功的Wistar 大鼠隨機分為模型組、黃精皂苷低劑量（35 mg／kg）組、黃 精 皂 苷 高 劑 量（70 mg／kg）組 及 厄 貝 沙 坦（17.5 mg／kg）組，每組10 只；另隨機選取10 只健康Wistar 大鼠作為正常組。灌胃給藥，1 次／d，正常組及糖尿病腎病模型組灌胃等體積的蒸餾水，給藥時間16 周。

2.2 標本留取與保存 在給藥的第4、8、12、16 周采用代謝籠收集大鼠24 h 尿液，離心取沉淀后，-20 ℃冰箱保存，用于24 h 尿蛋白定量測定。16 周給藥結束后，大鼠稱定體質量，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血4 mL，離心后分離血清，-20 ℃冰箱保存，用于尿素氮及血肌酐的測定。固定大鼠，打開胸腔，使心臟充分暴露，左心室插管輸入磷酸鹽緩沖液，待腎臟顏色變白后，取腎臟，稱定質量，用于腎臟系數的計算。取部分腎臟組織固定于10%福爾馬林溶液中，用于病理形態觀察；其余腎臟組織保存于-80 ℃冰箱，用于蛋白印跡實驗。

2.3 腎臟系數計算與生化指標測定 腎臟質量（mg）與體質量（g）之比值即為腎重指數。采用全自動生化分析儀測定尿素氮、及血肌酐，雙縮脲法測定24 h 尿蛋白定量。

2.4 腎臟組織病理形態觀察 各組大鼠腎臟組織經10%福爾馬林溶液固定24 h，切成2 mm 厚度組織片；將其放入一次性蠟盒中，用蒸餾水沖洗3 次，依次經乙醇梯度脫水、二甲苯透明及浸蠟步驟后，進行石蠟包埋。常規方法行蘇木素伊紅（HE）染色和過碘酸希夫（PAS）染色，觀察腎臟組織病理形態改變情況。

2.5 蛋白印跡試驗 取凍存于-80 ℃冰箱中的腎臟組織標本，用剪刀剪碎后，于冰上加入組織裂解液裂解30 min；離心后得上清液，考馬斯亮藍法測定總蛋白含有量。取20 μg待測蛋白，行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干法轉至聚偏二氟乙烯膜上；封閉后分別加入Ⅳ型膠原（1∶1 000）及Wnt4（1∶500）、β-catenin（1∶1 000）多克隆抗體，4 ℃冰箱放置過夜。三乙醇胺緩沖液漂洗3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育1～2 h；再漂洗3 次后，將膜浸入到顯影劑中直至出現蛋白條帶。以目的蛋白灰度值與內參蛋白GAPDH 灰度值之比表示蛋白相對表達量。

2.6 統計學方法 采用SPSS13.0 軟件，計量數據以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 對糖尿病腎病大鼠一般狀態及腎臟系數的影響 正常組大鼠皮毛光澤，反應靈敏，體質量穩定增加，狀態良好；糖尿病腎病模型組大鼠皮毛失去光澤，反應遲鈍，消瘦，狀態較差且食物攝入量、飲水量均明顯增加；黃精皂苷給藥組大鼠一般狀態同糖尿病腎病模型組，但程度較輕。與正常組比較，模型組大鼠腎臟系數明顯增加（P＜0.05）；給藥16 周后與模型組比較，黃精皂苷低、高劑量組大鼠腎臟系數明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 對糖尿病腎病大鼠腎臟系數的影響（±s， n=10）

表1 對糖尿病腎病大鼠腎臟系數的影響（±s， n=10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

3.2 對糖尿病腎病大鼠尿素氮及血肌酐的影響 與正常組比較，模型組大鼠尿素氮及血肌酐水平均明顯升高（P＜0.05）；給藥16 周后與模型組比較，黃精皂苷低、高劑量組大鼠尿素氮及血肌酐水平均明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 對糖尿病腎病大鼠尿素氮及血肌酐的影響（±s，n=10）

表2 對糖尿病腎病大鼠尿素氮及血肌酐的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

3.3 對糖尿病腎病大鼠24 h 尿蛋白總量的影響 與正常組比較，模型組大鼠在第4、8、12、16 周的24 h尿蛋白總量均明顯增加（P＜0.05），且隨著時間的延長逐漸升高；與模型組比較，黃精皂苷低、高劑量組在第8、12、16 周的24 h 尿蛋白總量明顯減少（P＜0.05）。見表3。

表3 對糖尿病腎病大鼠24 h 尿蛋白總量的影響（±s， n=10）

表3 對糖尿病腎病大鼠24 h 尿蛋白總量的影響（±s， n=10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

3.4 對糖尿病腎病大鼠腎臟病理形態的影響 HE 染色及PAS 染色結果顯示，正常組大鼠可見排列整齊的腎小管上皮細胞，腎小管及腎小球形態正常；模型組大鼠可見腎小管管腔擴大，部分腎小管上皮細胞空泡脫落、變性，近端小管上皮細胞刷狀緣減少，小管間質內有大量炎性細胞浸潤、基質增多，腎間質發生纖維化改變；黃精皂苷低、高劑量組腎小管上皮細胞空泡變性得到一定程度改善，炎性細胞浸潤、基質增多及纖維化情況較糖尿病腎病模型組減輕。見圖1～2。

3.5 對糖尿病腎病大鼠腎組織Ⅳ型膠原及Wnt4、β-catenin表達的影響 與正常組比較，糖尿病腎病模型組大鼠Ⅳ型膠原及Wnt4、β-catenin 表達均明顯升高（P＜0.05）；給藥16 周后，與糖尿病腎病模型組比較，黃精皂苷低、高劑量組大鼠Ⅳ型膠原及Wnt4、β-catenin 表達均明顯降低（P＜0.05）。見圖3、表4。

圖1 HE 染色（×200）

圖2 PAS 染色（×200）

圖3 蛋白印跡法檢測Ⅳ型膠原及Wnt4、β-catenin 的表達

4 討論

由于生活條件的改善及生活方式的轉變，使得糖尿病的患病人數逐年增加，其中30%～40% 的糖尿病患者會伴發腎臟損傷，即為糖尿病腎病［8］。糖尿病腎病是導致糖尿病患者終末期腎衰竭及死亡的主要原因，中醫藥在治療及延緩糖尿病腎病進展方面具有獨特優勢，已成為目前研究的焦點。傳統中藥大黃中的有效成分大黃酸能通過減少腎臟組織內皮素的生成改善糖尿病大鼠腎臟功能［9］；黃芪顆粒聯合雷公藤皂苷治療可以減少糖尿病腎病患者尿蛋白，抑制炎癥反應，具有較好療效［10］。本研究采用鏈脲佐菌素誘導的方法建立了糖尿病腎病大鼠模型，給予模型大鼠黃精皂苷16 周后，黃精皂苷組大鼠一般狀態及腎臟病理形態均得到一定程度的改善；同時，黃精皂苷組大鼠腎重指數、尿素氮、血肌酐及第8、12、16 周的24 h 尿蛋白總量明顯減少；以上結果表明，黃精皂苷對糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷具有保護作用。

基底膜增厚、腎間質小管數目增多及腎小球肥大是糖尿病腎病早期的主要病理特征，而隨著病程的進一步發展，細胞外基質積聚、腎間質小管萎縮和消失、腎小球硬化等晚期特征逐步出現，進而發生腎小管間質纖維化［11］。最新研究表明，腎小管間質纖維化是糖尿病腎病進展至終末期腎衰竭的主要病理基礎和共同途徑；在其形成過程中，Ⅳ型膠原的表達明顯升高，因而Ⅳ型膠原可以作為腎小管間質纖維化發生的重要證據［12］。本研究發現，給藥16 周后與模型組比較，黃精皂苷低、高劑量組大鼠Ⅳ型膠原表達明顯降低，表明黃精皂苷可以通過抑制腎小管間質纖維化進程而發揮腎臟保護作用。

表4 對糖尿病腎病大鼠腎組織Ⅳ型膠原及Wnt4、β-catenin 表達的影響（±s， n=10）

表4 對糖尿病腎病大鼠腎組織Ⅳ型膠原及Wnt4、β-catenin 表達的影響（±s， n=10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

Wnt 信號通路高度保守，在細胞增殖、分裂及凋亡過程中均扮演重要作用，此外也可以影響器官的發育和分化［13］。隨著研究不斷深入，Wnt 信號通路在腎臟疾病發生、發展中的重要性也逐漸得到了越來越多的重視。研究表明，Wnt 信號除了參與腎臟自身發育外，還參與腎小管間質纖維化、腎臟腫瘤、急性腎損傷、遺傳性多囊腎等多種疾病的發病過程；Wnt 信號通路的異常活化，會引起足細胞、間質小管上皮細胞及腎小球系膜細胞等腎臟固有細胞的凋亡與增殖，從而導致腎臟病的發生［14］。經典的Wnt／β-catenin 信號通路可以促使多種膜蛋白的相互作用，使Ⅳ型膠原表達增加，從而導致腎小管間質纖維化，進而引起腎臟不可逆的組織病理損傷［15］。鄧文超等［16］的研究證實，黃芪可以通過下調Wnt4、β-catenin 等蛋白的表達，延緩腎組織纖維化進程，進而發揮腎臟保護作用；Zou等［17］的研究表明，腎安顆粒可以調節糖尿病腎病大鼠尿蛋白、腎臟功能及血脂異常，而抑制Wnt／β-catenin 信號通路的活化是實現上述作用的原因；本研究同樣發現，給藥16周后，與糖尿病腎病模型組比較，黃精皂苷低、高劑量組大鼠Wnt4、β-catenin 表達均明顯降低，表明黃精皂苷可以阻斷Wnt／β-catenin 信號通路的異常激活，進而發揮腎臟保護作用。

綜上所述，黃精皂苷可以通過阻斷Wnt／β-catenin 信號通路的激活，抑制腎小管間質纖維化進程，最終發揮腎臟保護作用。