淺談藥品生產企業高效液相色譜法的規范化應用

北京市藥品認證管理中心（100053）張聯

高效液相色譜法是20世紀60年代初期在經典柱色譜基礎上，借鑒氣相色譜發展的經驗創立的分離分析技術[1]，可實現對絕大多數有機化合物的分離分析。基本原理是在高壓力下，利用不同組分在固定相和流動相之間相互作用力的差別，當兩相做相對移動時，各溶質在兩相間進行多次平衡，使各溶質相互分離。高效液相色譜法在藥品生產和質量控制中應用廣泛，涉及藥品鑒別、雜質控制、含量測定等諸多方面，已成為藥品檢驗的主流分析方法。

任何檢驗檢測的目的都是為了獲得穩定、可靠、準確和一致性的數據，但影響高效液相色譜法檢驗結果的因素很多，只有規范使用高效液相色譜法，保證檢驗方法適合于被檢樣品，同時確保檢驗人員有能力規范操作檢驗方法，才能取得可靠的數據。本文將以高效液相色譜法為中心，結合《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》、《中華人民共和國藥典》（2015年版）（以下簡稱《中國藥典》）以及相關技術性文件的原則要求，從質量體系、檢驗方法驗證以及檢驗操作等方面進行詳述，以促進藥品生產企業規范化應用高效液相色譜法，保障藥品質量。

1 制藥質量體系應涵蓋藥品檢驗過程

藥品生產企業應建立藥品質量管理體系，該體系應當涵蓋影響藥品質量的所有因素，包括確保藥品質量符合預定用途的有組織、有計劃的全部活動[2]，當然包括產品檢驗使用的高效液相色譜法。只有產品檢驗方法與企業質量體系有機融合并規范使用才能保證檢驗結果符合數據可靠性的要求。為了實現藥品質量，企業應配備充足的檢驗人員，人員應經過培訓、考核和評估，合格后方可上崗；企業高效液相色譜儀操作室的環境應符合《液相色譜儀檢定規程》（JJG705-2014）要求；企業應對儀器與試劑供應商進行評估分級，建立合格物料供應商清單并保證物料具有可追溯的適當質量；儀器應經過確認、定期檢定并保證儀器在生命周期中保持其驗證狀態。質量體系的正常運行需要企業定期開展審核評估，對審核發現的缺陷采取糾正和預防措施，每年對檢驗結果的趨勢進行分析，保證檢驗結果的穩定性。

2 高效液相色譜儀的基本要求

2.1 高效液相色譜儀管理 企業應根據在產產品檢驗需要配置適宜的高效液相色譜儀，包括自動進樣器、高壓泵、柱溫箱、檢測器、計算機（含適當的操作系統）和工作站軟件等。文件應明確儀器硬件變更、保養、維修后放行使用或停止使用的要求。新購或已安裝儀器關鍵硬件升級后均應進行安裝確認、運行確認和性能確認等工作，確認完成后應進行檢定，后續也應滿足檢定周期要求。高效液相色譜儀應有明確標識，應由授權人員操作儀器，使用時按照檢定規程要求進行使用中檢查，并應對儀器進行定期清潔保養，儀器的使用日志應記錄使用前檢查情況、使用情況和日常檢查項目。

2.2 高效液相色譜儀相關軟件的管理

2.2.1 企業應對計算機操作系統的系統時間進行控制，不能隨意更改。工作站軟件的用戶應實名登錄使用，禁止不同人員使用同一賬號或同一人員使用不同用戶名登錄。用戶管理中應對密碼長度、密碼更新周期、允許密碼輸入次數進行規定以防止非法登錄。企業應對使用者的權限進行分組，根據軟件使用者的不同需求對軟件操作權限進行分配。工作站軟件中崗位人員的權限分組應與企業文件規定、檢驗原始記錄一致。高效液相色譜儀工作站軟件配置方式目前常用的有三類：單機版，數據以文件形式儲存在計算機中；DB版，為數據庫形式，可控儀器數量1～4臺，數據存放在計算機中，一般采用雙硬盤備份；網絡版，配備服務器，是DB版的擴展版本，理論上數據存儲無限制，可控儀器數量無限制，數據存儲在專用服務器中，安全性最好。企業可根據被檢樣品的需要配置相應儀器，并應在使用前完成計算機化系統驗證。

2.2.2 工作站軟件審計追蹤功能 高效液相色譜儀的工作站軟件應開啟審計追蹤功能，記錄系統配置參數、儀器參數和數據分析參數的變更，實現數據審計追蹤功能，保證數據的可靠性。企業應定期審核用戶權限變更和數據審計追蹤系統，重點關注是否存在刪除、修改色譜圖和數據等不規范行為，包括改變色譜圖的峰面積和試驗的時間，從多做的數據中挑選符合主觀需求的數據，一圖多用，以及刪除、覆蓋或重命名色譜圖數據。

2.2.3 數據備份與還原測試 工作站軟件中的數據應定期備份，目前分為手動備份和自動備份，手動備份相當于文件存檔，在工作站軟件日志瀏覽器中可以查看；自動備份，按儀器說明書執行，可以采用定期定時的異地或A樓B樓備份，企業也可采用第三方軟件進行雙機熱備。企業在進行備份的同時應進行文件的還原測試，證明數據可恢復。

2.3 色譜柱的管理 色譜柱目前普遍使用商品化色譜柱，企業在采購檢驗標準中推薦的色譜柱時，應對色譜柱進行規范管理，包括色譜柱的采購、編號、首次使用柱效的測定、日常維護以及色譜柱的更換條件等，同時應根據供應商說明書的要求進行儲存。色譜柱使用前應關注色譜柱的儲存液與待分析樣品的流動相之間是否互溶。檢驗時色譜柱溫度會影響分離效果，檢驗標準中未指明色譜柱溫度時系指室溫。如檢驗方法耐用性驗證時發現室溫變化對色譜柱分離效果影響較大，則應在檢驗標準中明確給出柱溫規定。

附表 推薦的定量分析進樣測定序列

3 檢驗方法的管理

3.1 檢驗標準的確認 目前我國國家藥品標準包括《中國藥典》、部/局頒標準和進口藥品注冊標準，統稱為法定標準。通常藥品生產企業采用的檢驗標準均為藥品注冊批件中的質量標準。一般而言，國家藥品標準是對藥品的最基本質量要求，對于藥品生產企業來說，其出廠內控標準通常高于國家法定標準。所以企業應按照《中國藥典》的指導原則，以法定標準為基礎，結合企業產品的特點確認具體檢驗項目及限度要求。

3.2 檢驗方法驗證 任何檢驗檢測均需要通過確認或驗證的方式來證明該檢驗方法的正確性。當企業采用新建立的檢驗方法、檢驗方法需要修改變更或采用《中國藥典》及其他法定標準未收載的檢驗方法時，應當對檢驗方法進行驗證[2]。但檢驗方法的驗證結論不是持久永恒的，企業應根據生產或檢驗的變更進行再驗證，并通過對變更的風險評估確定驗證的廣度和深度。

3.2.1 檢驗方法驗證方式 企業必須與法定標準收載的方法進行比較，并證明它等同于或優于法定方法且必須進行驗證。通過實驗證明用于檢驗的分析程序適合于預期用途。檢驗方法驗證應作為驗證主文件的一部分，建立目的明確的驗證方案，驗證內容應包括《藥品質量分析方法驗證指導原則》[3]中規定的項目，驗證方案或報告中應記錄每一參數的接受標準和驗證結果，最后驗證報告結論應經正式批準。對不需要進行驗證的檢驗方法，企業應當對檢驗方法進行確認，以確保檢驗數據準確、可靠。

3.2.2 檢驗方法轉移 當檢驗方法不是由企業實驗室自行建立，而是委托其他實驗室完成時，兩個實驗室之間應當完成方法的轉移，以證明企業實驗室具有實施新方法的能力。在檢驗方法轉移中，方法通常要在不同實驗室，不同人員，不同儀器條件下使用，此時應依據實驗室和方法的特點選擇適宜的檢驗參數，進行再驗證或只對某些檢驗參數進行驗證(部分驗證)。轉移和接收實驗室應該在轉移驗證開始前就驗證參數和可接受標準達成一致，轉移實驗室應該為接收實驗室提供適當的培訓。

4 檢驗操作流程

4.1 檢驗操作準備

4.1.1 溶液配制 在檢驗操作中，為減少溶劑峰與色譜峰的畸變，應盡可能使用流動相按照檢驗標準的要求配制供試品溶液與對照品溶液，正確標識并按要求儲存。企業可根據檢驗需要考察配制的供試品溶液與對照品溶液的穩定性，同時個別產品須控制溶液配制后至進樣檢驗的時間間隔。4.1.2被檢樣品進樣測定序列 在執行檢驗方法過程中所有的步驟都要驗證，包括進樣的順序，推薦的定量分析進樣測定序列見附表，企業可根據被檢樣品酌情調整。驗證后的分析程序就是檢驗樣品的準則，只在驗證范圍之內變動是允許的，否則必須重新進行局部性的驗證。系統適用性試驗的對照品重復進樣應在被檢樣品檢驗前進行或在被檢樣品進樣時間隔進樣，并應貫穿檢驗始終包括檢驗結束時。系統適用性試驗如果不符合規定，必須立即停止儀器運作，進行OOS調查，修正后再重新開始。除了系統適用性試驗的五針之外，在隨后的對照品溶液進樣，要把對照品1的試驗結果加入，然后再計算相對標準偏差，任何時間，如果偏差過大必須停止運行。在檢驗的進樣測定序列完成后，從開始至結束所有的對照品1的數據，必須拿來計算該進樣序列的系統精密度。如果超標，那么整個數據不能使用。若有趨勢逐漸超標，應調查原因，并重新進樣，之前的數據不可使用但應記錄該過程。在檢驗進行過程中，如果發現有任何偏差，必須立即停止檢驗操作并開展偏差調查，只有對偏差調查結果采取適當的糾正預防措施后才可繼續進行檢驗操作。

4.2 被檢樣品檢驗

4.2.1 色譜系統的平衡 為了得到理想的檢驗結果，不僅需要有好的實驗方法，還需要有嚴謹的操作過程。企業應按照驗證的方法和進樣測定序列開展檢驗工作。色譜系統的平衡工作包括：泵沖洗；進樣器沖洗；使用流動相沖洗管路；預熱，流動相在低流速下工作直到柱溫達到室溫或各論規定的溫度；色譜柱柱平衡，使用標準規定的已脫氣流動相在規定的流速下平衡色譜柱；應檢查基線噪聲和基線漂移是否在設定值范圍內，可使用軟件的相應功能鍵進行基線檢查；基線斜率的計算結果應符合要求。

4.2.2 系統適用性試驗 檢驗之前進行系統適用性試驗是檢驗方法的組成部分，用于證明儀器、電子設備、分析操作適合被檢樣品，參數的選擇與檢驗方法的目的和性質有關，色譜系統常用參數如理論塔板數、分離度、靈敏度、重復性或拖尾因子等。實驗室應按驗證的方法對色譜系統進行系統適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，以確保試驗系統的有效性。必要時可對色譜系統進行適當調整以符合要求，品種正文項下規定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余參數可參考《中國藥典分析檢測技術指南》進行調整，以達到系統適用性試驗的要求。儀器或關鍵試劑變更應再次進行系統適用性試驗。不進行系統適用性試驗或系統適用性試驗失敗，則被檢樣品的檢驗結果不可接受。當對檢驗結果產生爭議時，仍以法定標準規定的色譜條件的檢驗結果為準。

4.2.3 數據采集 高效液相色譜儀工作站軟件的數據采集一般分為單次運行和實時批處理。數據采集參數包括停止時間、流動相流速、柱溫箱溫度、檢測波長、梯度洗脫不同流動相的比例等，在進樣時需輸入數據文件名稱、采樣瓶號和進樣體積等信息。實時批處理時批檢驗表格應符合企業驗證的進樣測定序列。

4.3 數據分析 企業在對色譜圖進行積分過程中的參數設定應與驗證過程和文件要求一致，包括疊加峰處理，基線漂移，未分離峰的積分，峰面積的計算，舍棄不需要的小峰等。企業應禁止隨意改變峰面積以使檢驗結果符合標準要求的行為，包括通過調整積分參數的方式改變峰面積大小；通過設置最小積分面積或高度舍棄主觀不想要的色譜峰；鎖定積分時間程的形式變更總積分面積；違規處理拖尾峰。企業根據產品檢驗需要可設置手動積分權限，但應對積分權限的使用進行嚴格控制。

4.4 檢驗報告 企業應制定檢驗報告的管理文件，規定色圖譜報告模板至少應包括頁眉、信息欄、色譜圖、峰表、頁腳等信息。批準的檢驗報告、工作站軟件中的報告模板應與文件規定一致。

高效液相色譜法是藥品生產企業控制藥品質量的關鍵技術，是保證藥品質量的關鍵一環。企業應以專業知識為基礎，按照藥品生產質量管理規范和數據可靠性的要求，建立科學的制藥質量體系。通過體系文件、必要的驗證、嚴格的操作、同步記錄等規范化的使用，保證取得的檢驗數據真實可靠，有效保障藥品質量。