抑酸治療對肺纖維化大鼠的影響研究

舒艷梅，楊興娜，王金梁

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種局限于肺部的慢性進行性纖維化性間質性肺炎［1］，其組織病理學和/或胸部高分辨率CT 特征性表現為尋常型間質性肺炎（UIP），主要病理表現為彌漫性肺泡損傷和肺泡結構紊亂，最終導致肺泡結構破壞，形成肺纖維化和蜂窩肺。IPF 患者主要臨床表現為刺激性干咳、進行性加重的呼吸困難等，少數患者表現為逐步、可預見性的肺功能下降，極少數患者病情呈快速進行性發展。近年來IPF 發病率呈逐年上升趨勢，致殘率、病死率較高，預后較多種癌癥更差，中位生存時間為2.8～4.2 年，肺移植后中位生存時間約為4.5 年，5 年生存率約為20%，故被稱為“類腫瘤疾病”［2］。據報道，歐洲和北美地區IPF 發病率為（2.8～9.3）/10 萬［3］。

目前，臨床尚無能有效逆轉肺纖維化過程的藥物。近年來，多項研究表明IPF 患者常合并胃食管反流（gastroesophageal reflux disease，GERD）［4-7］，而GERD所致的反復微小吸入可能與IPF 發生有關，肺部微生態相關機制研究也提到GERD 是IPF 的危險因素之一［5］。HAN 等［8］研究結果顯示，約56.4%的IPF 患者存在GERD。MOLYNEAUX 等［9］學者發現，IPF 急性加重患者多表現為彎曲桿菌屬增多，而彎曲桿菌屬主要來自消化道，推測可能是由于消化系統內容物的潛在微小誤吸所致。但多數IPF 患者為“隱性反流”，GERD 的臨床癥狀并不明顯，因此易被漏診或誤診。近年來隨著24 h食管pH 監測儀應用于臨床，人們逐漸發現GERD 可能對IPF 產生影響。2011 年，LEE 等［10］通過回顧性分析204 例IPF 患者病例資料發現，抑酸治療與IPF 患者生存時間延長有關，但目前其具體作用機制尚未完全明確。本研究旨在探討抑酸治療對肺纖維化大鼠的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2017-06-21 至2017-08-17，選取36只普通級雄性健康SD 大鼠，體質量150～200 g，由河南科技大學模式動物研究室提供，普通環境飼養。

1.2 主要試劑 博來霉素試劑（河南天池生物科技有限公司生產），醋酸潑尼松（哈藥集團制藥四廠生產，國藥準字H23020185），鹽酸雷尼替?。ò⑻鼐S斯制藥有限公司生產，國藥準字H44021231），丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所生產），烏拉坦溶液（河南科技大學模式動物研究室提供），鹽酸溶液（河南科技大學模式動物研究室提供）。

1.3 分組及造模 將36 只健康雄性SD 大鼠隨機分為對照組（n=10）、肺纖維化組（n=6）、雷尼替丁組（n=10）及潑尼松組（n=10）。肺纖維化組、雷尼替丁組及潑尼松組大鼠均一次性經鼻滴入博來霉素7 μg/g 建立肺纖維化模型［11］，對照組大鼠經鼻滴入相同劑量0.9%氯化鈉溶液。造模后，雷尼替丁組大鼠予以鹽酸雷尼替丁30 mg·kg-1·d-1連續灌胃28 d［12］，潑尼松組大鼠予以醋酸潑尼松6 mg·kg-1·d-1［13］連續灌胃28 d，對照組大鼠予以相同劑量0.9%氯化鈉溶液連續灌胃28 d。造模后7 d 隨機選取肺纖維化組1 只大鼠處死，造模后14 d 隨機選取肺纖維化組1 只大鼠處死，造模后28 d 將肺纖維化組剩余4 只大鼠全部處死，行肺組織病理切片觀察肺纖維化情況以驗證是否造模成功。

1.4 觀察指標

1.4.1 取材 造模后28 d，四組大鼠均采用20%烏拉坦溶液（5 ml/kg）腹腔注射麻醉，經腹主動脈抽取動脈血檢測血清MDA 水平及動脈血氧分壓（PaO2）；腹主動脈放血處死大鼠，開胸取出肺組織后用0.9%氯化鈉溶液漂洗數次，采用4%多聚甲醛液固定肺組織，常規石蠟包埋，進行HE 染色。

1.4.2 肺纖維化嚴重程度 結合肺組織HE 染色結果，按照SZAPIEL 等［14］提出的方法評估肺纖維化嚴重程度，肺纖維化嚴重程度判定標準見表1。

表1 肺纖維化嚴重程度判定標準Table 1 Criteria for severity of pulmonary fibrosis

1.4.3 血清MDA 水平 取大鼠腹主動脈血，4 000 r/min離心10 min（離心半徑13.5 cm），留取血清并置于-20 ℃環境下保存待測，采用TBA 法配制試劑，嚴格按照MDA 試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 PaO2采用經低分子肝素鈣肝素化的注射器抽取大鼠腹主動脈血，頂端使用肝素帽封閉，冷藏環境下15 min 內送至河南科技大學第一附屬醫院神經內科重癥監護室，采用美國雅培I-STAT1300-G 型血氣分析儀檢測PaO2，以評估肺氧合功能。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料分析采用χ2檢驗；等級資料分析采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學特征 HE 染色結果顯示，對照組大鼠肺組織結構正常，肺泡腔透亮，無明顯充血水腫，肺泡壁薄，肺泡內未見明顯滲出，未見明顯急慢性炎性改變及纖維化表現，肺纖維化嚴重程度（-），見圖1A。肺纖維化組大鼠造模后7 d 部分肺泡腔內可見少量滲出及炎性細胞浸潤，肺纖維化嚴重程度（+），見圖1B；造模后14 d 有較多肺組織內可見炎性細胞浸潤和少量膠原沉積，肺纖維化嚴重程度（++），見圖1C；造模后28 d，肺組織內可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡間隔增寬，肺泡腔內有大量成纖維細胞增殖及膠原沉積，肺纖維化嚴重程度（+++），見圖1D，提示造模成功。造模后28 d，雷尼替丁組和潑尼松組大鼠肺泡炎性反應及纖維化嚴重程度均較肺纖維化組減輕，見圖1E～1F。

2.2 肺纖維化嚴重程度、血清MDA 水平及PaO2實驗過程中雷尼替丁組1 只大鼠死亡，潑尼松組3 只大鼠死亡。造模后28 d 四組大鼠肺纖維化嚴重程度及血清MDA 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；肺纖維化組、雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴重程度劣于對照組，血清MDA 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴重程度優于肺纖維化組，血清MDA 水平低于肺纖維化組，差異有統計學意義（P＜0.05）。造模后28 d四組大鼠PaO2比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 四組大鼠造模后28 d 肺纖維化嚴重程度、血清MDA 水平及PaO2比較Table 2 Comparison of severity of pulmonary fibrosis，serum MDA level and PaO2 in the four groups 28 days after modeling

3 討論

圖1 四組大鼠肺組織病理學特征（HE 染色，×400）Figure 1 Pathological features of pulmonary tissue in the four groups

IPF 是特發性間質性肺炎的常見類型，常起病隱匿，好發于中老年人群，臨床癥狀輕重不一，大多數患者表現為緩慢、逐步、可預見的肺功能下降；少數患者反復發生急性加重；極少數患者表現為進行性加重的呼吸困難，可嚴重影響患者的生活質量。IPF 的主要病理表現為明顯纖維化或結構改變，伴或不伴有蜂窩肺，肺間質內膠原過度沉積和纖維母細胞過度增殖，斑片狀肺實質纖維化和成纖維細胞灶形成。目前，IPF 的具體發病機制尚未完全明確，且尚無能有效逆轉肺纖維化過程的藥物。

糖皮質激素是治療IPF 的經典藥物，能抑制多種免疫效應細胞功能及各種細胞因子的合成、分泌，從而減輕IPF 患者肺泡炎癥及纖維化，改善患者臨床癥狀，常用于IPF 急性加重期；此外，糖皮質激素還可通過選擇性誘導肺內炎性細胞凋亡而改善博來霉素所致肺纖維化模型大鼠肺泡炎性反應及肺纖維化程度［15］。

近年來，多項研究表明IPF 患者常合并GERD，而GERD 所致的反復微小吸入可能與IPF 發生有關［4-7］，提示GERD 可能是IPF 的潛在病因。抑酸治療可能會延長IPF 患者生存時間，但具體機制尚未完全明確。雷尼替丁是臨床常見的抑酸藥物，其可有效緩解胃酸過多所致的胃痛、胃灼熱感、反酸等，常用于全身麻醉或大手術后及衰弱昏迷患者預防胃酸反流合并吸入性肺炎。本研究選用雷尼替丁作為抑酸藥物，結果顯示，肺纖維化組、雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴重程度劣于對照組，雷尼替丁組、潑尼松組大鼠肺纖維化嚴重程度優于肺纖維化組；HE 染色結果顯示，造模后28 d 雷尼替丁組和潑尼松組大鼠肺泡炎性反應及纖維化嚴重程度均較肺纖維化組減輕，提示抑酸治療能在一定程度上減輕肺纖維化大鼠肺纖維化嚴重程度，與糖皮質激素作用相似。

正常生理條件下，自由基在機體內分布較為廣泛，僅極少量自由基與氧結合轉變成氧自由基而參與機體生理反應、生化反應、免疫反應等；此外，氧自由基還能與不飽和脂肪酸相互作用而使脂質微循環紊亂，導致細胞膜通透性和完整性遭到破壞，進而引起細胞結構及功能改變，最終形成脂質過氧化物。MDA 是過氧化脂質的主要代謝產物，其水平變化可直接反映組織中脂質過氧化程度及間接反映氧自由基含量［16-18］，此外還可衡量機體氧化應激反應程度［19-20］。本研究結果顯示，造模后28 d 肺纖維化組、雷尼替丁組、潑尼松組大鼠血清MDA 水平高于對照組，雷尼替丁組、潑尼松組大鼠血清MDA 水平低于肺纖維化組，提示抑酸治療能在一定程度上減輕肺纖維化大鼠脂質過氧化反應，與糖皮質激素作用相似。PaO2是評估肺氧合功能的臨床指標之一。本研究結果顯示，造模后28 d 四組大鼠 PaO2比較無統計學差異，提示抑酸治療對肺纖維化大鼠肺氧合功能無明顯影響，分析其原因可能與樣本量較小、實驗條件及實驗周期有限有關。

綜上所述，抑酸治療能在一定程度上減輕肺纖維化大鼠肺纖維化嚴重程度及脂質過氧化反應，但對肺氧合功能無明顯影響，與糖皮質激素作用相似；但本研究為動物實驗，僅提供了初步實驗數據；此外，肺纖維化發病機制較為復雜，因此抑酸治療對肺纖維化的影響仍有待進一步研究證實。

作者貢獻：舒艷梅、楊興娜、王金梁進行文章的構思與設計；舒艷梅、楊興娜進行研究的實施與可行性分析，進行數據收集、整理、分析；舒艷梅進行結果分析與解釋，負責撰寫論文；舒艷梅、王金梁進行論文的修訂；王金梁負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。