中國(guó)倉(cāng)鼠口腔鱗癌miR-504的表達(dá)特征分析

衛(wèi)佳寧, 續(xù)國(guó)強(qiáng), 高繼萍, 王曉堂, 肖蘭飛, 宋國(guó)華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病模型動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030001)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占頭頸部惡性腫瘤的90%左右[1]，其發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢(shì)[2]。每年頭頸部惡性腫瘤新發(fā)病患者人數(shù)高達(dá)60萬(wàn)例[3,4]，且患病人群趨向于年輕化[5]，這對(duì)人類健康和生命構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

微小RNA(microRNA，miRNA)是具有調(diào)控基因表達(dá)功能的非編碼小分子單鏈RNA, 在癌癥以及其他疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用, 參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的調(diào)控過(guò)程, 發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用。關(guān)于miRNA在OSCC方面的研究有: miR-29b-1-5p誘導(dǎo)OSCC的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]; miR-125b通過(guò)靶向抗氧化因子過(guò)氧化物樣酶2A(peroxiredoxin-like 2A, PRXL2A)來(lái)抑制口腔致癌性[7]; miR-127-3p靶向驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin-like protein，KIF3B)以抑制OSCC的發(fā)展[8]; miR-199a-5p通過(guò)靶向絲氨酸-蘇氨酸激酶/核因子κB (IKKβ/ NF-κB)信號(hào)通路在OSCC中起腫瘤抑制劑的作用[9]等相關(guān)研究，miR-504是我們課題組前期通過(guò)對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC模型高通量測(cè)序篩選得到的，目前其在OSCC方面的相關(guān)研究知之甚少。

中國(guó)倉(cāng)鼠是我國(guó)具有特色的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其口腔兩側(cè)各有一個(gè)伸縮性大的頰囊，頰囊組織主要由纖維組織、鱗狀上皮細(xì)胞及疏松結(jié)締組織構(gòu)成，血供豐富，微血管網(wǎng)密、顏色淡、透光性好，是進(jìn)行OSCC研究的理想動(dòng)物模型[10]。本實(shí)驗(yàn)室完成了中國(guó)倉(cāng)鼠口腔頰囊組織miRNA高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，鑒定得到差異表達(dá)的miRNA共有268個(gè), 137個(gè)表達(dá)上調(diào), 131個(gè)表達(dá)下調(diào), 其中miR-504表達(dá)下調(diào)[11]。本文對(duì)miR-504進(jìn)行了克隆測(cè)序, 并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 采用qRTPCR方法鑒定miR-504中中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC模型的癌組頰囊和癌旁舌組織的不同階段的表達(dá)特征, 為OSCC中miR-504下游相關(guān)通路研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立及分組

選取清潔級(jí)雄性中國(guó)倉(cāng)鼠90只，8～10周齡，體質(zhì)量30～40 g(誤差不大于10%)，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)[SCXK(晉)2015-0001];90只中國(guó)倉(cāng)鼠分為3組: 空白組30只、陰性對(duì)照組12只、實(shí)驗(yàn)組48只, 空白組不做處理，陰性對(duì)照組涂抹丙酮，實(shí)驗(yàn)組涂抹丙酮溶解的0.5%二甲基苯丙蒽(9,10-Dimethy1-1, 2-Benzanthracence，DMBA)。倉(cāng)鼠分籠飼養(yǎng)在屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中[SCXK(晉)2015-0001]，飼養(yǎng)室溫度 23～25 ℃，環(huán)境相對(duì)濕度40%。涂藥后禁食禁水2 h，其余時(shí)間自由進(jìn)食和飲水，仔細(xì)觀察每只鼠的生活狀況，對(duì)外觀產(chǎn)生病變的鼠及時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。

1.2樣本采集及病理HE染色

模型建立開(kāi)始，隔日涂一次DMBA。定期在造模6周、12周和18周解剖13只(8只實(shí)驗(yàn)組+5只對(duì)照組)倉(cāng)鼠取樣：取倉(cāng)鼠的左右頰囊和舌組織，將采集的一部分頰囊組織和所有舌組織做好標(biāo)記立即放入液氮中冷凍，然后于-80℃冰箱中保存，以備提取RNA; 另一部分頰囊組織放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24～72 h，然后進(jìn)行乙醇溶液梯度脫水、石蠟包埋、切片、伊紅-蘇木素(HE)染色、中性樹(shù)脂封片。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol試劑(日本TaKaRa公司)提取組織中的RNA, 按照說(shuō)明書(shū)操作。用酶標(biāo)儀(FLX-8000型, 美國(guó)Gene公司)對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行定量評(píng)估，參照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)合成cDNA，10 μL反應(yīng)體系: mRQ Buffer (2×) 5 μL，組織中提取的miRNA(0.25～8 μg) 3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL。在PTC-200PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序設(shè)置：第一步在單引物的介導(dǎo)和反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA: 37℃，60 min; 第二步加熱后cDNA與RNA鏈解離: 85℃, 5 min。最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的 cDNA 第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4miR-504前體序列的克隆

中國(guó)倉(cāng)鼠中miR-504的成熟體序列來(lái)自miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，將成熟體序列比對(duì)到OSCC基因組，得到miR-504前體的基因組序列，根據(jù)所獲得的序列設(shè)計(jì)特異性miR-504引物(表1)，用于擴(kuò)增miR-504的前體序列，克隆得到了符合預(yù)期結(jié)果的片段，連接到GV268載體上(GENE，吉?jiǎng)P基因)，轉(zhuǎn)化質(zhì)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證得到陽(yáng)性克隆的序列，將測(cè)序結(jié)果在miRBase(http://www.mirbase.org/)上進(jìn)行BLAST分析，并使用miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件The mfold Web Server（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）對(duì)miR-504前體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.5頰囊和舌中miR-504實(shí)時(shí)定量分析

使用RT-PCR方法檢測(cè)miR-504在中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC四個(gè)階段中的表達(dá)特征。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)正向引物基于 miRNA 成熟體序列設(shè)計(jì), 反向引物使用 miRcute miRNA qPCR (TaKaRra公司, 日本)檢測(cè)試劑盒自帶的引物。用U6基因作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，25 μL 反應(yīng)體系: 正向引物 0.5 μL，反向引物0.5 μL，ROX Dye (50×) 0.5 μL，miRNA第一鏈cDNA 2.0 μL，SYBR Advantage Premix (2×) 12.5 μL，ddH2O 9 μL。在Real time PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)程序設(shè)定，反應(yīng)條件，步驟 1∶95℃ 5 min；步驟2∶95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù), Ct值取3個(gè)重復(fù)的平均值, 結(jié)果以 2-ΔΔct相對(duì)表達(dá)量表示[12]。2-ΔΔCt計(jì)算方法: ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組 Ct內(nèi)參基因)]。

表 1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.6miR-504的qRT-PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 對(duì)PCR結(jié)果的數(shù)據(jù)采用±s表示，結(jié)果采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)間的兩兩比較采用單因素方差分析法(ANOVA)中的LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)倉(cāng)鼠頰囊組織病理學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下，正常頰囊組織棘細(xì)胞層薄，基底層細(xì)胞明顯、排列整齊, 釘突不明顯，空白組和陰性對(duì)照組組織學(xué)觀察一致, 未出現(xiàn)異常改變(圖1A和B); 模型組在6周時(shí)頰囊黏膜出現(xiàn)輕度充血，病理觀察可見(jiàn)棘層細(xì)胞增厚, 基底層細(xì)胞形態(tài)正常，相對(duì)于正常組略微增厚, 極少數(shù)釘突形成(圖1C); 12周時(shí)黏膜增厚, 病理觀察見(jiàn)棘層細(xì)胞明顯增厚，基底層細(xì)胞增生且呈明顯改變，釘突較6周明顯增寬(圖1D); 18周時(shí)局部有白斑樣病變和糜爛，病理觀察見(jiàn)棘層細(xì)胞呈單個(gè)或成團(tuán)角化，基底層細(xì)胞增厚，大部分的基底層細(xì)胞異常增生，大量細(xì)胞極性消失，散亂排列(圖1E)。

圖 1 中國(guó)倉(cāng)鼠頰囊黏膜癌變的組織病理學(xué)觀察 (HE×200)Figure 1 Histopathological observation of mucosal carcinogenesis in Chinese hamsters (HE×200)

2.2miR-504前體序列的克隆及測(cè)序驗(yàn)證

測(cè)序結(jié)果去除載體后顯示片段大小為325 bp,將該序列在miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示該序列與野豬、獼猴、黑猩猩、犬、牛、人、小鼠等的miR-504具有同源性。測(cè)序比對(duì)結(jié)果如下(紅色為miR-504前體序列):

2.3 miR-504前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò) The mfold Web Server 分析, 頰囊 miR-504前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)有6個(gè)，其中由最小折疊自由能(Δ G =-76.40 kcal/mol)形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定 (圖 2)，可以看出口腔頰囊miR-504 前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)具有典型的頸環(huán)結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和 miRBase 前體序列同源性分析，在前體序列中發(fā)現(xiàn)了miR-504的成熟體序列，確認(rèn)克隆得到的序列為miR-504 前體序列。

2.4miR-504在OSCC頰囊組織四個(gè)階段表達(dá)量

采用qRT-PCR方法檢測(cè)頰囊樣本中miR-504的表達(dá)量，miR-504和內(nèi)參U6特異性擴(kuò)增，熔解曲線均為單一峰，特異性較好。采用2-ΔΔct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每周組織的個(gè)體數(shù)為3只，每個(gè)至少重復(fù)3次，可以準(zhǔn)確反映miRNA的表達(dá)情況。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，miR-504在頰囊組織中的表達(dá)特征如下：在6周、12周和18周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量約是空白組的0.83、0.33，0.23倍; 12周時(shí)的表達(dá)量顯著低于前一個(gè)時(shí)間段(P＜0.001)，其余兩組兩兩比較差異有顯著性(P＜0.05); 相對(duì)于空白組，實(shí)驗(yàn)組miR-504的表達(dá)水平均較低(圖3左)。

圖 2 miR-504 前體序列形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)Figure 2 Hairpin structures formed by precursor sequences of miR-504

圖 3 中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC的miR-504相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Relative expression of miR-504 in OSCC of Chinese hamster

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, miR-504在舌組織中的表達(dá)特征如下：在6周、12周和18周時(shí)，miR-504在舌組織的相對(duì)表達(dá)量約是正常舌組織的0.92、0.84、0.27倍， 12周和18周miR-504的相對(duì)表達(dá)量差異性極顯著(P＜0.01)，相應(yīng)的miR-504的表達(dá)水平不斷降低(圖3右)。

2.5中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC模型中癌組織頰囊和癌旁組織舌中miR-504表達(dá)差異比較

結(jié)果顯示, 相對(duì)于正常組織, 在6周、12周、18周的實(shí)驗(yàn)組頰囊和癌旁舌組織中miR-504的表達(dá)水平在不斷下調(diào)，且差異有顯著性(圖4)。

圖 4 中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC的miR-504表達(dá)水平Figure 4 Expression of miR-504 in OSCC of Chinese hamster

3 討論

近年來(lái)，除了基于臨床的對(duì)OSCC相關(guān)病因、診斷標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后的回顧性研究，研究人員越來(lái)越重視OSCC動(dòng)物模型的建立，旨在進(jìn)行OSCC發(fā)病機(jī)制與抗癌藥物藥理學(xué)的研究。目前關(guān)于OSCC動(dòng)物模型方面有注射法建立金黃倉(cāng)鼠頰囊癌模型[13]，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%的4-硝基喹林-1-氧化物(4-NQO)飲水法誘導(dǎo)Wistar大鼠舌白斑癌變動(dòng)物模型[14]等。每種方法有各自的特點(diǎn)，相對(duì)于飲水法，涂抹法能有效避免OSCC癌變以外的并發(fā)癥。本研究使用的中國(guó)倉(cāng)鼠源于我國(guó)，具有中國(guó)特色的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用其兩側(cè)大頰囊的特點(diǎn)制備OSCC動(dòng)物模型具有顯著優(yōu)勢(shì)。

前期的研究采用二代高通量測(cè)序技術(shù)篩選出與OSCC通路相關(guān)的差異表達(dá)的基因miR-504[11],本文研究了miR-504在中國(guó)倉(cāng)鼠頰囊和舌組織中的表達(dá)特征。首先克隆得到中國(guó)倉(cāng)鼠miR-504前體,經(jīng)The mfold Web Server對(duì)前體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),miR-504能形成經(jīng)典的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。初級(jí)miR-504經(jīng)過(guò)2個(gè)步驟的剪切最終形成成熟的miR-504。第一步在細(xì)胞核中，初級(jí)miR-504由RNase Ⅲ內(nèi)切酶家族的Drosha酶剪切成頸環(huán)結(jié)構(gòu)的miR-504前體; 第二步在細(xì)胞質(zhì)中，由RNase Ⅲ內(nèi)切酶家族的Dicer酶剪切成RNA雙鏈復(fù)合體，該復(fù)合體在Dicer酶作用下解旋, 其中一條或者兩條與AGO蛋白形成RNA的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。包含RNA的RISC通過(guò)成熟miRNA識(shí)別沉默靶標(biāo)，并與靶標(biāo)基因的mRNA的3’非編碼區(qū)域進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo)RISC與靶標(biāo)基因結(jié)合或?qū)袠?biāo)基因降解，從而達(dá)到調(diào)控靶標(biāo)基因表達(dá)的目的[15]。與人類基因組的其他區(qū)域或基因座相比，miRNA基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)較低[16,17]。此外, Han等[18]通過(guò)NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘數(shù)據(jù)和分析指出miRNA的保守性, 概因二級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能的重要性影響了miRNA基因中SNP的積累。

目前, 關(guān)于miR-504在其他疾病及相關(guān)信號(hào)通路中的研究有不少。如miR-504通過(guò)抑制Frizzled-7介導(dǎo)的Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)而在肝細(xì)胞癌中起腫瘤抑制劑的作用[21]; miR-504通過(guò)在非小細(xì)胞肺癌中靶向賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)來(lái)抑制細(xì)胞增殖和侵襲[22]; miR-504通過(guò)靶向腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)的核蛋白1(TP53INP1)促進(jìn)人骨肉瘤中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[23]; miR-504還是一種腫瘤抑制性microRNA，通過(guò)靶向人腦膠質(zhì)瘤中的FOXP1來(lái)抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]; 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)通過(guò)激活miR-504 / FOXP1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)OSCC的侵襲性[24]。這些研究為探討miR-504在OSCC發(fā)生發(fā)展中分子機(jī)制提供了借鑒。

本實(shí)驗(yàn)顯示, DMBA涂抹過(guò)的頰囊中miR-504的表達(dá)下調(diào), 而癌旁舌組織中miR-504的表達(dá)先降低后升高。有文獻(xiàn)[19]報(bào)道, miR-504在FOXPI(FOX家族基因)的相關(guān)通路中高表達(dá)并發(fā)揮促癌作用;在周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinases 6, CDK6)的相關(guān)通路中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用[20]。癌組頰囊和癌旁組舌中miR-504的表達(dá)出現(xiàn)的差異，可能與相關(guān)信號(hào)通路上的調(diào)控機(jī)制相關(guān)。

綜上所述，DMBA涂抹法建立的中國(guó)倉(cāng)鼠OSCC動(dòng)物模型為研究OSCC的發(fā)病機(jī)理提供了可靠的材料，顯著下調(diào)的miR-504與OSCC的發(fā)生機(jī)制有關(guān)，可能是OSCC診斷的潛在標(biāo)志物。因此，從miR-504對(duì)OSCC的致病機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的研究具有重要意義，可為臨床OSCC的早發(fā)現(xiàn)早治療提供依據(jù)。