短發夾RNA TRPV4基因對脊柱側彎大鼠模型椎間盤退變的抑制作用

李 琰, 孔建軍, 陳子奇, 祝聰聰

(1. 冀中能源邢臺礦業集團總醫院骨科, 邢臺 054000;2. 邢臺醫學高等專科學校第二附屬醫院內科, 邢臺 054000)

青少年特發性脊柱側彎(adolescent idiopathic scoliosis, AIS)是兒童骨科常見的疾病之一，其特點是伴有椎體旋轉和剃刀背[1]。AIS不僅影響青少年的身體發育，還影響身體的美觀，對青少年的心理發育產生負面影響，被稱為青少年生長發育的“五大殺手”之一[2]。隨著我國“晚婚晚育”基本國策的深入實施，越來越多的高齡產婦出現，兒童先天性疾病也相應增多[3]。其中AIS被認為是與松果體中褪黑素的水平密切相關[4]。有研究[5]表明，我國AIS的發病率為1.5%～3%，女孩多見。因此，尋找一種有效的早期干預手段對青少年的發育具有重要意義。

瞬時感受器電位(transient receptor potential,TRP) 超家族成員是機體內一類廣泛分布的非選擇性陽離子通道[6]，瞬時感受器電位香草素(transient receptor potential vanilloid, TRPV)是TRP通道中的一種亞型[7,8]。TRPV4 是具有一離子選擇性的外向整流陽離子通道,能感受胞外滲透壓的變化, 與機械力學信號密切相關[9]。基因工程中的RNA干擾技術是針對特發性疾病比較有效的干預手段[10]。對于AIS的治療，既往研究[11,12]大多集中于內分泌干預, 而很少關注椎體本身的病理發展。本實驗以機械激活性離子通道TRPV4為切入點, 從脊椎生物力學角度探究短發夾RNA(shRNA)-TRPV4對于椎間盤髓核細胞的保護作用，以期為AIS的早期干預提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級雌性離乳SD大鼠30只，體質量為(91.3±3.6) g，購自山東省實驗動物中心[SCXK(魯)2016-0893]; DMEM 培養液購自美國 Gibco 公司。鼠源性II型膠原，多聚蛋白多糖(Aggrecan)人基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和誘導型一氧化氮合成酶iNOS抗體購自美國 Abcam 公司; 白細胞介素1(IL-1)和IL-6 ELISA試劑盒購自北京碧云天試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗對象SD大鼠飼養于邢臺醫學高等專科學校實驗動物研究中心SPF級設施[SYXK(冀)2007-1193]，室溫為(22.9±4.2) ℃，相對濕度為45%～55%，無菌飼料喂養。根據實驗目的，將30只SD大鼠分成對照組，模型組和shRNA組3組，每組10只。

1.2.2 脊柱側彎鼠模型的構建 采用經典的雙足大鼠脊柱側彎模型構建方法[13]。采用手術方法將SD大鼠截去前肢和尾巴，術中嚴格無菌操作，術后常規抗生素處理，應用6-巰基嘌呤腹腔注射,每月1次，構建SD大鼠脊柱側彎模型。利用影像學資料檢查SD大鼠脊柱側彎模型的成功率。對照組大鼠常規飼養，不作任何處理; shRNA組:SD大鼠構建脊柱側彎鼠模型, 每月攝片，CT定位下T12-L1椎體注射10 μL shRNA-TRPV4慢病毒載體; 模型組: SD大鼠構建脊柱側彎鼠模型，CT定位引導下T12-L1椎體注射等量生理鹽水。1.2.3ShRNA-TRPV4干擾載體構建根據siRNA干擾原理，GeneBank數據庫查詢鼠源性TRPV4基因序列，針對TRPV4的開放閱讀框(ORF)序列構建siRNA干擾序列，利用環狀RNA構建shRNATRPV4干擾載體，人源胚胎腎(HEK)細胞篩選有效序列，所有構建和篩選工作由上海吉凱生物有限公司完成。

1.2.4 影像學攝片 利用本醫療中心影像科X線攝片機器，對上述3組動物進行攝片，并記錄3組的cobb角度。

1.2.5 組織病理學染色3組動物處理3個月后,處死大鼠，取T12-L1節段椎體和椎間盤，分別作石蠟包埋冰凍切片和直接冰凍切片，用于作HE染色和免疫組織化學染色。前者二甲苯脫蠟后，97%和80%乙醇溶液浸潤30 min，自來水沖洗，HE染色封片。后者質量分數4%甲醛溶液固定，BSA孵育，孵育II型膠原蛋白一抗和Aggrecan蛋白一抗，放入濕盒，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min; HRP二抗避光孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，封片。切片用倒置顯微鏡觀察。

1.2.6 RT-PCR檢測大鼠髓核組織中相關因子的mRNA表達水平 處理3個月后處死大鼠, 取T12-L1節段椎間盤髓核組織，研磨棒充分研磨。利用Trizol法提取RNA，TaKaRa熒光定量PCR試劑盒檢測iNOS, 炎癥相關因子環氧合酶2(COX-2)、MMP-9、凋亡相關因子B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2家族抗凋亡因子(Bad)、Bcl-2家族相關X蛋白(Bax)，以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 -3(Caspase-3),Caspase-6和Caspase-9的mRNA表達水平, 根據反應體系的不同, 加入各試劑。采用上海RT-PCR儀器進行分析, 總時間設置為2 h。

1.2. 7Western-blotting檢測iNOS，MMP-9的蛋白表達水平 處理3月后處死大鼠，取T12-L1節段椎間盤髓核組織，研磨棒充分研磨。RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白, 95 ℃金屬浴煮沸后備用，同時按照Western blotting制膠說明配置分離膠和濃縮膠，查詢iNOS和MMP-9的分子量，根據分子量大小選擇配置10%分離膠和20%濃縮膠。加入20 μL上樣蛋白, 直流電電泳100 min，交流電電泳10 min。待蛋白電泳分離后, 等離子轉膜后, 加入iNOS和MMP-9鼠源一抗(Abcam公司, 1∶1 000稀釋), 4 ℃避光孵育過夜(＞12 h)。12 h 后 PBST 洗膜, 每次 20 min, 加入山羊抗鼠IgG二抗(艾美捷科技有限公司, 1∶5 000稀釋), 避光孵育1.5 h，PBST洗膜, 每次20 min,重復3次，DAB顯影液處理。Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.8 免疫組織化學染色3組動物處理3月后，處死大鼠，取T12-L1節段椎體和椎間盤，冰凍切片機切片, 質量分數4%甲醛溶液固定, BSA孵育，孵育II型膠原蛋白一抗和Aggrecan蛋白一抗,放入濕盒，4℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min; HRP二抗避光孵育30 min，PBS清洗3次，每次5min; 封片后倒置顯微鏡觀察。

表 1 目的基因的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene

1.3 統計學處理

應用SPSS18.0進行統計學分析, 結果用表示。對照組、模型組和shRNA組比較采用單因素方差分析方法, 組間差異采用q檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 shRNA-TRPV4 慢病毒載體的構建和轉染

以HEK-293細胞為檢測細胞，以綠色熒光蛋白(GFP)為熒光探針，檢測shRNA-TRPV4的慢病毒載體的構建。結果表明, 0.011 μL慢病毒量轉染效率較高，為90.3%(圖1)。

2.2 影像學表現

對照組SD大鼠未發生側彎; 模型組SD大鼠脊柱向左側彎, cobb角為35.22°±2.18°; shRNA組SD大鼠脊柱向左側彎, cobb角為24.07°±3.09°(圖 2)。

2.3 模型大鼠髓核組織中相關因子的mRNA表達

模型組髓核組織中iNOS,COX-2,MMP-9,Bad,Bax和凋亡相關因子Caspase-3,Caspase-6,Caspase-9的mRNA表達水平均高于對照組(P＜0.05), 而抗凋亡因子Bcl-2的表達水平要低于對照組(P＜0.05)。shRNA組髓核組織中iNOS，COX-2，MMP-9，

Bad，Bax和凋亡相關因子Caspase-3、Caspase6和Caspase-9的mRNA表達水平均高于對照組(P＜0.05)，而抗凋亡因子Bcl-2的表達水平要低于對照組(P＜0.05)。shRNA組髓核組織中iNOS，COX-2，MMP-9，Bad，Bax和凋亡相關因子Caspase-3，Caspase6，Caspase9的mRNA表達水平均低于模型組(P＜0.05)，而抗凋亡因子Bcl-2的表達水平要高于模型組(P＜0.05)(圖3)。

圖 1 shRNA-TRPV4 慢病毒載體的構建和轉染(100×)Figure 1 Construction and transfection of lentivirus vector shRNA-TRPV4 (100×)

Figure 2 Imaging findings of three groups in SD rats

2.4 Western blotting 表達

shRNA組髓核組織中iNOS和MMP-9的蛋白表達水平均高于對照組(P＜0.05)，而低于模型組(P＜0.05)(圖 4)。

2.5 免疫組織化學染色觀察

shRNA組髓核組織中II型膠原蛋白和Aggrecan蛋白的蛋白表達水平均低于對照組(P＜0.05)，而高于模型組(P＜0.05)(圖 5,圖 6)。

3 討論

3.1 青少年特發性脊柱側彎與椎體的異常機械應力密切相關

到目前為止，AIS病因學研究的重點在于動物模型的構建[14,15]。有學者[16]曾對SD大鼠采用切除大腦松果體和腹腔注射褪黑素抑制劑的方法構建脊柱側彎模型，結果2組大鼠均未發生脊柱側彎。而采用切除前足的方法，即使不切除松果體或者腹腔注射褪黑素抑制劑，也會導致大鼠發生脊柱側彎。所以他們認為哺乳動物的脊柱側彎與2足動物模型的構建有關。其原因可能是脊柱受力不均，引起各椎體生物力學失衡，進而導致在不同力學刺激下，椎體發生旋轉，導致脊柱側彎的形成。機械激活性離子通道TRPV4與機械力學信號的傳導密切相關。有研究[17]表明，TRPV4的過度表達可以促進軟骨細胞凋亡，加劇骨性關節炎進展。因此，本實驗以機械激活性離子通道為切入點，探究TRPV4對于脊柱側彎SD大鼠模型中髓核細胞凋亡的作用機制。

圖 3 大鼠髓核組織中相關因子的mRNA表達Figure 3 The expression of related factors in nucleus pulposus of rats

圖 4 大鼠髓核組中相關蛋白表達Figure 4 The expression of iNOS and MMP-9 protein in nucleus pulposus of rats

3.2shRNA-TRPV4可以抑制髓核細胞的凋亡且降低II型膠原和多聚蛋白多糖的流失

基因工程中的RNA干擾技術是針對特發性疾病比較有效的干預手段。shRNA技術可以特異性阻斷靶基因的表達，降低細胞中靶基因和靶蛋白的表達水平[18,19]。本實驗通過構建shRNA-TRPV4載體，借助慢病毒方法，在CT引導下注射側彎最明顯的T12-L1節段，結果顯示shRNA組髓核組織中凋亡相關因子Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9的表達量均低于模型組(P＜0.05)，表明shRNA-TRPV4可以抑制異常應力下髓核細胞凋亡。

圖 5 髓核組織中II型膠原蛋白免疫組織化學染色 (DAB×200)Figure 5 Immunohistochemical staining of type II collagen in nucleus pulposus (DAB×200)

圖 6 髓核組織中Aggrecan蛋白免疫組織化學染色(DAB×200)Figure 6 Immunohistochemical staining of Aggrecan protein in nucleus pulposus (DAB×200)

II型膠原蛋白和Aggrecan是髓核組織的主要組成部分, 對髓核組織正常形態的維持以及生物力學減震方面均具有重要意義, 而髓核組織退變的主要標志就是II型膠原蛋白和Aggrecan的流失[20]。免疫組織化學染色結果顯示，shRNA組I型膠原蛋白和Aggrecan的含量均高于模型組(P＜0.05)，表明shRNA-TRPV4可以抑制異常應力下II型膠原蛋白和Aggrecan的流失。

3.3 shRNA-TRPV4可以抑制髓核組織中iNOS

以及炎性因子COX-2和MMP-9的表達

在異常生物力學刺激下，除了髓核細胞的過度凋亡，炎性因子的表達量增多也是椎間盤變性的標志之一[21]，其中誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的表達水平與氧化自由基密切相關。氧化自由基增多會激活炎性因子COX-2和MMP-9的表達，從而增加髓核組織內的炎癥因子表達，加劇髓核組織的變性[22]。本實驗結果表明，shRNA組中iNOS以及炎性因子COX-2和MMP-9的mRNA表達水平要明顯低于模型組，Western blotting再次驗證了在蛋白水平上, shRNA組中iNOS 和MMP-9的蛋白表達水平要明顯低于模型組, 提示shRNA-TRPV4可以抑制髓核組織中iNOS以及炎性因子COX-2和MMP-9的表達, 但是并不能完全抑制; 因為shRNA組中iNOS以及炎性因子COX-2和MMP-9的mRNA表達水平要明顯高于對照組，結果表明shRNA-TRPV4可以延緩脊柱側彎大鼠模型的髓核細胞退變，而不能完全阻止，需要聯合手術矯形等其他方法。

綜上所述，shRNA-TRPV4可以抑制脊柱側彎鼠模型中髓核細胞的凋亡，降低髓核組織中iNOS以及炎性因子COX-2和MMP-9的表達，對髓核組織的退變起到保護作用。