山羊胎肝內人臍帶間充質干細胞的存活與分化研究

鄢東海, 黃小昆, 向雪萍, 卿德科, 方 偉, 李自安, 王 強, 王金祥, 龐榮清

(1. 聯勤保障部隊第920醫院干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室、云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室、云南省干細胞工程實驗室, 昆明 650032;2. 昆明醫科大學920醫院臨床學院, 昆明 650031)

臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC)是一種取材方便、分化潛能較強的成體干細胞，是再生醫學研究常用的種子細胞。雖然UCMSC在體外一定的誘導條件下可以向脂肪、軟骨和成骨組織分化[1], 但在體內免疫監控的環境條件下是否可以向肝細胞分化？其在體內究竟如何生存、遷移、分化以及組織錨定？這些基本問題一直是再生醫學研究關注的焦點和難點[2]，需要可靠的科學實驗進行驗證研究。胚胎發育期由于免疫系統尚未發育成熟，被認為是研究干細胞分化的理想環境[3]。運用胚胎發育期的特殊微環境，研究UCMSC的基本科學問題，可以為其轉化應用提供科學依據，并已經在細胞移植、免疫耐受研究和移植器官來源等諸多方面展示了無限的希望和潛在的應用價值[4]。本研究首次將人UCMSC(hUCMSC)注射到處于胚胎發育期的胎羊肝臟實質區域，以構建人-山羊肝臟嵌合體，觀察hUCMSC在胎羊肝臟發育特定微環境內的生存和變化，為hUCMSC用于人類肝病治療甚至將來器官培育提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑培養液DMEM/F12、新生牛血清和trypsin-EDTA均購自美國Gibico公司，攜帶綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因的慢病毒載體購自吉滿生物公司, DNA/RNA提取、cDNA合成、人雄性性別決定基因(SRY)等基因引物及PCR Mix試劑盒購自美國Promega公司，免疫組織化學染色用抗人單抗[兔抗人肝細胞核因子3β(HNF3β)、兔抗人 HNF4α和兔抗人白蛋白 (ALB）購自美國Abcam公司。

1.1.2 實驗動物 2只雌性妊娠山羊來源于醫院實驗動物中心，用于胎肝內定位注射實驗研究[SYXK(軍)2012-0039]。

1.1.3 人臍帶組織 經醫院倫理委員會的批準[批件號2017027]，來源于健康男嬰的臍帶用于分離hUCMSC。

1.1.4 實驗儀器Eclipse 80i熒光顯微鏡為日本Nikon公司生產; BX41生物顯微鏡為日本Olympus公司生產; C1000 PCR擴增儀和Gel Doc XR凝膠成像儀均為美國BIO-RAD公司生產。

1.2GFP轉染標記hUCMSC的準備

采用本課題組前期建立的hUCMSC分離培養及其轉染標記方法[1,5]制備男嬰來源的hUCMSC并進行綠色熒光蛋白(GFP)轉染標記。即剪碎的男嬰臍帶在含10%牛血清的DMEM/F12培養體系中擴增出貼壁生長的第三代細胞，經流式細胞測定細胞免疫表型并進行體外成脂、成骨、成軟骨誘導分化實驗鑒定為間充質干細胞后，按照轉染復數50的劑量往生長良好的第三代hUCMSC培養液中加入攜帶GFP的慢病毒載體液共培養48 h，生理鹽水漂洗后消化收集細胞，熒光顯微鏡下觀察確定標記成功的細胞，即GFP-hUCMSC，用生理鹽水重懸后調整細胞濃度為108/mL用于胎肝內定位注射實驗。

1.3 胎肝內細胞定位注射

采用本課題組前期建立的胎肝內定位注射方法[6]，即選擇交配后經超聲探查確診妊娠2個月的山羊，固定并腹部消毒后，在B超引導下穿刺至胎羊肝臟實質區域，連接裝有1 mL細胞懸液(含108個男性GFP-hUCMSC)的注射器，準確將GFP-hUCMSC懸液注射到3只孕齡2個月的胎羊肝臟實質區域。陰性對照為孕齡相同的胎羊，以同樣方式注射1mL生理鹽水。

1.4 GFP陽性細胞的觀察

胎羊出生后1個月, 手術切取部分肝臟組織,用OTC(一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋后制作冰凍切片, 滴加DAPI染色后直接在熒光顯微鏡下觀察GFP陽性細胞的分布并拍照。

1.5 人雄性性別決定基因(SRY)基因的檢測

切取適量肝臟組織，快速加入液氮研磨后用DNA試劑盒提取DNA, 以PCR方法擴增人SRY基因, PCR擴增引物序列及擴增條件見表1。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀上觀察目的條帶并拍照。未注射細胞的羔羊肝臟為陰性對照, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為內參。

1.6 人肝細胞特異基因的檢測

切取適量肝臟組織，快速加入液氮研磨后用RNA提取試劑盒提取總RNA，用first Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA，以RT-PCR方法檢測人肝細胞特異基因肝細胞核因子3 β(Hepatocyte nuclear factor 3β, HNF3β)、肝細胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)和白蛋白(albumin, ALB)的表達, RT-PCR擴增引物序列及條件見表1。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后, 于凝膠成像儀上觀察目的條帶并拍照。未注射細胞的羔羊肝臟為陰性對照,GAPDH為內參。

1.7 人肝細胞特異蛋白的檢測

切取部分肝臟組織, 用體積分數10%甲醛溶液固定后制作石蠟切片, 經脫蠟、水化、抗原修復后, 檢測人肝細胞特異蛋白細胞核因子HNF3β、HNF4α和ALB的表達, 分別滴加相應的一抗(人抗兔 HNF3β、HNF4α、ALB), 在濕盒內 4℃孵育過夜, 磷酸鹽緩沖液漂洗3次, 滴加抗兔生物素化二抗, 室溫條件下孵育30 min, 磷酸鹽緩沖液漂洗3次后蘇木素復染2 min, 在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 GFP陽性細胞的觀察

肝臟組織用OTC包埋后制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下可觀察到接受胎肝內細胞注射的山羊肝臟內廣泛存在綠色熒光信號, 細胞核呈特有的藍色, 即有GFP-hUCMSC分布, 有的集中分布并形成規則結構(圖1A), 有的以單個信號散在分布于肝臟組織(圖1B)，而接受胎肝內注射相同體積生理鹽水的對照山羊肝臟內觀察不到GFP-hUCMSC分布(圖 1C)。

表 1 PCR或RT-PCR擴增引物及其退火溫度

圖 1 羔羊肝臟組織內GFP-hUCMSC分布

2.2人SRY基因PCR擴增

采用PCR檢測方法，可以從接受胎肝內細胞注射的所有羔羊肝臟組織DNA中檢測到人SRY基因的表達，即長度為120 kb的目的條帶，而沒有接受胎肝內細胞注射的對照組羔羊肝臟組織DNA中擴增不到目的條帶(圖2)。

圖 2 羔羊肝臟組織人SRY基因PCR檢測

2.3 人肝細胞特異基因在羔羊肝組織中表達

采用RT-PCR檢測方法，可以從接受胎肝內細胞注射的山羊肝臟組織總RNA中檢測到人ALB基因(長度為245 kb的目的條帶)和HNF3β基因(長度為240 kb的目的條帶)(圖3)及HNF4α基因(長度為113 kb的目的條帶)(圖4)的表達，而沒有接受胎肝內細胞注射的對照組山羊肝臟組織中檢測不到人肝細胞特異基因的表達。

2.4 人肝細胞特異蛋白在羔羊肝臟中表達

肝臟切片免疫組織化學染色，可以從接受胎肝內細胞注射的羔羊肝臟組織中檢測到人ALB蛋白和人HNF4a蛋白的表達, 卻檢測不到人HNF3β蛋白的表達(結果未顯示)。ALB可規律地圍繞肝小葉靜脈周圍集中分布而呈現棕黃色環狀結構(圖5A)，或者散在分布而呈現棕黃色點狀或片狀結構(圖5B)。HNF4α多呈棕黃色環狀結構分布(圖6A、B)。而沒有接受胎肝內細胞注射的對照羔羊肝組織中未觀察到棕黃色染色(圖5C)。

圖 3 羔羊肝臟組織人ALB基因和HNF3β基因RT-PCR 檢測

圖 4 羔羊肝臟組織人HNF4α基因RT-PCR檢測

圖 5 羔羊肝臟組織人ALB免疫組織化學染色分析

圖 6 羔羊肝臟組織人HNF4α免疫組織化學染色

3 討論

肝移植被認為是治療終末期肝衰竭最有效的方法，但供肝短缺和免疫排斥問題在很長時期內很難解決。運用干細胞具有多項分化潛能的獨特生物學特性獲取功能性肝細胞，已成為近年來再生醫學研究追求的主要目標之一[7]。體外研究[1]已經證實，UCMSC可以被誘導向脂肪、軟骨及成骨組織分化，這為UCMSC的轉化應用帶來了新的希望。本研究將來源于男嬰臍帶并經基因轉染標記的GFP-hUCMSC，定位注射于2月齡胎羊肝臟實質區域。母羊分娩后，手術切取出生1個月的羔羊肝臟組織，在熒光顯微鏡下可以在冰凍切片視野內找到GFP陽性的熒光信號，而且這些熒光信號可集中分布形成一定規則的結構，表明定位注射的GFP-hUCMSC不僅可以在免疫系統尚未發育成熟的山羊胚胎發育期的特殊生理環境條件下存活，而且獲得了生長機會，與羔羊肝臟組織形成了兩種來源細胞相互移居共存的嵌合狀態。這與臍帶血宮腔內移植和UCMSC治療肝纖維化研究報道一致[2,8]。

為了進一步驗證植入細胞在出生1個月的新生羔羊肝臟組織中的存在, 本研究從分子水平檢測了人類男性Y染色體上特定基因片段(SRY基因)的存在。Y染色體是雄性動物細胞特異性的基因結構, 它不受細胞表型變化和移植時間的影響, 追蹤Y染色體細胞的存在, 是鑒定嵌合細胞最可靠的方法, 也是GFP轉基因標記示蹤技術的有效補充。結果證實，接受胎肝內定位注射來源于男嬰的hUCMSC并順利分娩生產的羔羊, 包括雌性羔羊肝臟組織, 其肝臟組織中均可擴增出人SRY基因片段, 大小約為120 kb, 而對照組未擴增出人SRY基因片段。結合綠色熒光信號分布的肝臟組織學觀察, 充分證明了所移植的來源于男嬰的hUCMSC可以在羔羊肝臟組織內存活并形成嵌合狀態定居。

為了追蹤植入細胞的演變去向，本研究運用RT-PCR方法和免疫組織化學染色方法從分子和蛋白水平鑒定了人肝細胞相關基因和蛋白的存在。結果顯示，接受胎肝內定位注射hUCMSC并順利分娩生產的羔羊，出生1個月后其肝臟組織內可以檢測到人HNF3β、HNF4α和ALB基因的表達，而沒有接受細胞注射的陰性對照同齡羔羊肝臟檢測不到這些基因的表達。運用抗人的單抗進行免疫組織化學染色，結果顯示，注射過hUCMSC的實驗羔羊肝臟組織中只可檢測到HNF4α和ALB蛋白的表達，HNF4α主要位于靜脈周圍，ALB廣泛分布于靜脈周圍等肝小葉很多區域。沒有接受細胞注射的陰性對照羔羊肝臟組織中檢測不到這些蛋白的表達。實驗結果進一步證明，定位注射的hUCMSC不僅在胚胎發育期的胎羊肝臟內存活并獲得了進一步生長發育的機會，而且在胎羊出生后，隨著羔羊免疫系統的發育和成熟，免疫耐受也隨之形成，植入的hUCMSC在胎肝生理微環境條件下分化為人類肝細胞樣的細胞，至少在mRNA和蛋白水平表達了人類肝細胞的部分特異標志，在一定程度上形成了功能性人肝細胞樣細胞，體現了人肝細胞的特定生物學功能。UCMSC具有向肝細胞分化的潛能在其它相關的體內外研究報道中也得到驗證[8,9]。

肝富集轉錄因子(liver-enriched transcription factors)是一組主要存在于肝臟并調控肝特異基因表達的轉錄因子，在器官發育的調控中發揮著關鍵作用[10]，促進肝臟的代謝[11]，主要包括6個家族的因子，其中HNF3β是參與肝臟發育過程的肝富集轉錄因子級聯調控網絡中最重要的轉錄因子,在胚胎發育的早期表達，對HNF4α等轉錄因子有調控作用。HNF4α是一種鋅指結構蛋白, 其氨基酸序列在進化過程中高度保守，在肝細胞發育和分化過程中發揮重要作用[12]。在肝臟發育早期，HNF4α即可激活一些肝臟基因表達, 如甲狀腺激素結合蛋白等，但還是在成熟的肝細胞中表達量最高, 是調控肝細胞分化和維護肝細胞生物學功能的重要轉錄蛋白，在肝臟的形成和成人肝臟許多基因的轉錄調節中起關鍵作用。本研究結果顯示，接受細胞注射的新生1月齡羔羊肝臟組織中可以檢測到人HNF3β和HNF4α基因的表達，但免疫組織化學方法只能檢測到人HNF4α蛋白的表達，檢測不到人HNF3β蛋白的表達，此結果可能提示，HNF3β主要高表達于hUCMSC向肝細胞分化的早期過程，羔羊出生后其表達水平就大幅降低，致使本研究只能在mRNA水平上檢測到其表達，而不能在蛋白水平檢測到其表達。而由于HNF4α主要高表達于成熟肝細胞，是維護肝細胞正常生物學功能的重要因子，因此，本研究可以在mRNA和蛋白水平上均可檢測到其表達。白蛋白(ALB)主要由肝細胞合成分泌，是鑒定成熟肝細胞功能的經典指標，本研究可以在mRNA和蛋白水平上檢測到人ALB的表達，表明HNF4α維持了hUCMSC向肝細胞樣細胞分化的結果。

本研究結果初步表明，hUCMSC在胎羊肝臟發育的特定微環境內，可以存活并獲得了進一步生長發育的機會，其在免疫系統逐步發育成熟的羔羊肝臟內維持至少一個月，這預示著免疫耐受基本形成，hUCMSC用于人類肝病治療至少在嬰幼兒或許是可行的。