乙酰膽堿合并氯化鈣靜脈注射致兔和大鼠房顫模型的比較

馮 凱, 楊蕾熙, 成祎琳, 尉延春, 陶 如, 周童心, 湯依群

(中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院, 南京 211198)

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常類型。隨著年齡的增加，發病率不斷升高。AF可引起心房功能障礙，導致栓塞、心力衰竭、甚至猝死[1]。AF發生機制尚未完全清楚，常用的AF模型以犬和羊等大型動物制備[2]，成本昂貴且不易操作。本實驗室通過條件優選，建立了乙酰膽堿(Ach)合并氯化鈣(CaCl2)(Ach-CaCl2)混合液靜脈注射制備大鼠AF模型，此模型操作相對簡單，AF發生率高，心電圖典型，對藥物治療敏感，心房重構明顯，已被廣泛采用[3-6]。

大鼠心房較小，難以形成穩定多重折返波，模型AF持續時間較短，AF發生時，出現連續f波，較少出現房顫發作時患者常見的f波心室波混雜的心電圖。同時，大鼠心房離子通道分布和種類，如瞬時外向鉀電流(Ito)等通道與人類差別較大[7]，房顫誘發的心電重構與臨床有較大差異。相對犬，羊等實驗動物，兔易于獲得，飼養成本低，其心臟離子通道種類和分布與人類接近，注射給藥容易操作。本研究主要目的為在大鼠AF模型的基礎上，制備兔AF模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級3月齡雄性新西蘭兔44只，體質量2～2.5kg, 購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場[SCXK(蘇)2017-0011]。SPF級2月齡雄性SD大鼠16只，體質量250～300 g，購自浙江省實驗動物中心[SCXK (浙) 2014-0001]。動物飼養和實驗操作于中國藥科大學實驗動物中心[SYXK (蘇) 2016-0011]進行。通過中國藥科大學實驗動物倫理委員會審查，且實驗過程中嚴格遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

Ach購自美國Sigma公司(批號: BCBR3675V);HE，Masson染色試劑盒購自賽維爾生物科技有限公司 (批號: 170240); CaCl2購自上海凌風化學試劑有限公司 (批號20150914); 氯化鈉購自西隴科學股份有限公司 (批號: 1708061); 戊巴比妥鈉購自德國Merck 公司 (批號: 09/2017); 水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司 (批號: 20110210)。

TE124S電子天平(萬分之一)購自德國Sartorius公司; BL-420S生物信號采集與分析系統成都泰盟軟件有限公司; 生物組織脫水染色機，石蠟包埋機和石蠟切片機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司; 數字病理切片掃描儀購自濱松光子學商貿(中國)有限公司；大鼠固定器購自北京搏貝科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠AF模型制備[3]心電圖正常SD大鼠16只, 適應性喂養1周后, 隨機分成2組: 對照組6只和模型組10只。模型組: SD大鼠ip水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。尾靜脈注射Ach(66 μg/kg)-CaCl2(10 mg/kg)混合溶液，重復給藥10 d，每日1次，記錄給藥后大鼠的AF持續時間。對照組: 操作同模型組，Ach-CaCl2混合溶液用生理鹽水代替。BL-420S生物機能實驗系統記錄Ⅱ導聯心電圖，以f波出現和p波消失作為AF發生的標志，以f波消失和p波出現作為竇性心律恢復的標志，記錄AF持續時間。

1.3.2 兔AF模型制備[3]兔飼養1周后，乙醚麻醉，固定于操作臺，將BL-420S生物信號采集與分析系統的白色，黑色和紅色電極分別插入兔右前肢，右后肢和左后肢皮下，檢測兔心電圖，選取心電圖正常的兔進行造模條件優選，麻醉劑使用上，選用戊巴比妥鈉代替水合氯醛，優選最佳麻醉劑量和濃度，同時對Ach-CaCl2混合溶液的濃度及靜脈注射速度等進行優化，以獲得穩定的房顫為主要衡量標準。

1.3.3 心房組織病理學觀察 實驗結束后, 麻醉并處死動物, 取大鼠和兔的心房, 用生理鹽水洗去血液, 分別放置在體積分數10%的甲醛溶液中固定48 h, 脫水, 包埋, 切片, 之后進行HE染色和Masson染色, 在光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.4 統計學方法

本實驗采用SPASS 11.0操作系統對數據進行了統計分析，所有的數據均以表示，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔AF模型條件優選

2.1.1 麻醉劑 與體積分數10%水合氯醛組相比,體積分數0.5%戊巴比妥鈉麻醉兔維持時間較短(P＜0.01)，約30 min(表1)，且無死亡現象(水合氯醛組第2、第3日分別死亡1只和2只)。在本實驗中，選用0.5%戊巴比妥鈉取代10%水合氯醛麻醉動物，戊巴比妥鈉給藥劑量30 mg/kg，麻醉時間和效果均能滿足實驗要求(表1)。

表 1 不同麻醉藥兔麻醉持續時間min

2.1.2 給藥劑量與0.7 mL/kg相比, 耳緣靜脈注射Ach(66 μg/mL)-CaCl2(10 mg/mL)混合溶液 1 mL/kg,AF持續時間較長(P＜0.01)(表2)。

2.1.3 給藥速度 實驗結果顯示，15 s注射組兔均死亡, 60 s注射組，兔AF持續時間較短, 30 s注射組， AF持續時間較長(P＜0.01)(表3)。

通過上述實驗，我們采用以下條件制備兔AF模型：耳緣靜脈注射體積分數0.5 %戊巴比妥鈉(6 mL/kg)麻醉后，1 mL/kg 的 Ach(66 μg/mL)-CaCl2(10 mg/mL)混合溶液以 30 s勻速耳緣靜脈注射誘發AF。觀察連續藥物刺激不同時間(10 d和28 d )對AF持續時間以及心房結構的影響，與大鼠模型進行比較。

表 2 Ach -CaCl2給藥劑量對兔AF持續時間的影響 s

表3 不同給藥速度兔AF持續時間 s

2.2 兔和大鼠AF模型比較

2.2.1 心電圖實時監控給藥時大鼠和家兔的Ⅱ導聯心電圖, 結果顯示, 大鼠尾靜脈注射Ach(66 μg/kg)-CaCl2(10 mg/kg)混合溶液后，均出現典型的AF波形f波，p波消失，且R-R間期不等。兔耳緣靜脈注射Ach(66 μg/kg)-CaCl2(10 mg/kg)混合溶液后，AF波型與大鼠不同，均出現大量的小波并夾雜不規則的心室波(圖1)。

圖 1 兔和大鼠給藥后II導聯心電圖的改變

2.2.2 AF持續時間大鼠連續10 d給藥后，AF持續時間逐漸升高，在第4～7 日，處于平臺期，約11 s。之后逐漸升高，第10 日達到最高，約17 s。兔連續10 d給藥，AF持續時間起伏較大，分別在第3日和第6日達到最大，約121 s。兔連續給藥28 d，AF持續時間在造模前15 d波動明顯，15 d后AF持續時間逐漸平穩(圖2)。

2.2.3 心房組織病理學改變房顫模型建立成功之后，每組分別取3只動物心房組織進行HE和Masson染色，觀察其病理結構改變。AF大鼠心房組織HE染色結果顯示，正常組與AF造模10 d的大鼠均無明顯差異，其細胞結構完整，輪廓清晰，排列相對整齊，無炎性浸潤; Masson染色結果顯示: 正常組大鼠心肌細胞大小均勻, 胞質被染成紅色, 心肌纖維間有輕微的膠原; AF造模10 d大鼠，纖維間均有大量膠原產生，表明發生了嚴重的纖維化。AF兔心房組織HE染色結果顯示，正常組、AF造模10 d和AF造模28 d心房組織細胞結構均完整，輪廓清晰; AF造模28 d相對于正常組和AF造模10 d, 均有較多的細胞核, 未觀察到炎性浸潤。AF兔Masson染色結果顯示，正常組心房組織胞質被染成紅色，組織間含有少許膠原。AF造模10 d和28 d心房組織間均含有大量的膠原，但與AF造模10 d相比，AF造模28 d兔心房組織組織間膠原含量更多，心房組織纖維化更嚴重(圖3)。

圖 2 兔和大鼠AF持續時間

2.2.4 動物死亡率統計 大鼠造模過程中，分別于第2日、第9日和第10日各死亡1只。兔造模過程中分別于第20日和第25日各死亡1只。

3 討論

本實驗室在探討建立大鼠AF模型實驗中，曾對多種藥物誘發AF進行篩選，烏頭堿，強心苷等，在大鼠等小動物，很難誘發典型的AF。給予CaCl2可誘發多種心律失常，AF發生不穩定且不規則，Ach單獨給予，傳導阻滯和心率減慢為最常見的心電異常類型。文獻查閱結合實驗條件選優，我們將CaCl2與Ach混合注射，誘發動物AF。AF的誘發率高且重復性較好。Ach能夠與大鼠心房肌細胞M2(毒蕈堿受體M2亞型)受體結合, 進而激活Ach依賴性鉀通道(acetylcholine-dependent K+-current, IkAch), 縮短動作電位(Action potential, AP)時程和有效不應期(effective refractory period，ERP), 由于IkAch在心房不同部位分布密度不同，致使心房電離散度增大，AF的發生率增加，AF持續時間延長[8,9]。大量研究[10]表明AF的發生和維持與鈣離子通道的改變有關。大鼠體內瞬時注入大量鈣離子可使心房肌細胞外的鈣離子濃度增加, 誘發心電異常。長時間的鈣超載使心房肌細胞鈣通道關閉, 甚至表達降低。L-型鈣離子電流(ICa-L)是動作電位平臺期除極的主要電流。鈣通道蛋白表達降低，導致鈣離子內流減少，心房肌細胞動作電位除極減慢，ERP縮短，促使AF發生[11]。本實驗在家兔上采用Ach-CaCl2混合溶液誘導AF發生，在預實驗階段分別對Ach(33 μg/mL, 66 μg/mL, 132 μg/mL)和Cacl2(5 μg/mL,10 μg/mL)的濃度進行調整, 結果顯示 Ach(66 μg/mL)-CaCl2(10 mg/mL)誘導，AF持續時間最長，此結果與我們前期大鼠AF制備濃度相同。

生物機能實驗系統全程監控2種動物造模過程中心電圖變化。本實驗條件下，大鼠容易出現典型的AF波(p波消失，f波出現)。兔AF時，f波和心室波混雜出現，與人類AF時的心電圖極為相似，這可能是由于兔心臟較大，對Ach和CaCl2的敏感性和表面交感神經分布與大鼠不同所致[12]。在連續造模刺激反應性方面，與大鼠相比，兔每次AF持續時間長，但日間波動較大。這可能是由于兔的心房組織較大，微小的子波折返容易形成。同時兔對AF的代償，導致AF持續時間日間波動較大。為此我們延長兔造模時間，發現隨著時間延長(28 d)，AF持續時間逐漸穩定。大鼠AF持續時間在造模10～14 d即達平臺，延長造模時間，AF持續時間未見明顯延長(未發表數據)。

圖 3 大鼠和兔HE和Masson染色結果

在麻醉劑的選擇方面，本研究換用了戊巴比妥鈉，在藥物濃度的選擇上，常用濃度為3%，但安全范圍較窄，高濃度注射給予，容易出現麻醉過深引起死亡，特別對于模型動物。我們參考劉為萍等[13]研究，麻醉藥物濃度為0.5%，給藥體積6 mL/kg。本實驗條件下，動物麻醉時間約為30 min左右，符合實驗需求。

Masson染色結果顯示，大鼠和兔在AF10 d后均出現顯著的纖維化。AF造模28 d后，兔心房的纖維化更為明顯，這可能是AF持續時間延長的原因。 為了觀察兔AF模型對藥物的敏感性，我們用模型兔，耳緣靜脈注射胺碘酮(5 mg/kg)，觀察治療作用，結果顯示胺碘酮能夠顯著降低兔AF持續時間, 提示模型對藥物敏感。在大鼠模型基礎上, 本實驗建立了兔陣發性AF模型。此模型采用耳緣靜脈給藥, 操作簡單, 容易掌握, 通過調整麻醉劑, 模型死亡率降低。相對于大鼠，兔與人類AF時心電圖的改變和AF持續時間的波動性更為相似, 離子通道種類和分布與人類更為接近, 更適合于AF電重構機制的研究。兔心房組織較大,也為后續有效開展分子生物學實驗提供保障。