舒郁膠囊及其主要組份對經前期綜合征肝氣郁證大鼠海馬中Cav1.2介導的CaM/CaMKⅡ信號通路的影響

徐凱勇, 王杰瓊, 李 芳, 耿燕楠, 夏小雯, 宋春紅

(1. 山東中醫藥大學, 教育部中醫藥經典理論研究重點實驗室,山東省中醫藥基礎研究重點實驗室, 濟南 250355;2. 北京市豐臺區婦幼保健院藥劑科, 北京 100067)

經前期綜合征(PMS)是典型中醫情志病癥，肝氣郁證為主要證型，肝疏泄失常為其關鍵病機，具體機制有待深入探索。有研究發現Ca2+的濃度變化與PMS的發生有關[1,2]。L型鈣通道(Cav1.2)是細胞內Ca2+濃度調節的重要通道，細胞內Ca2+與鈣調蛋白(CaM)結合可激活鈣調蛋白依賴的蛋白激酶II(CaMKII)，其作用底物參與調控與PMS發生有關的腦源性營養因子(BDNF)、五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)和谷氨酸(Glu)等蛋白質和神經遞質的合成和釋放。我們前期研究[3]表明, PMS肝氣郁證大鼠血清可顯著抑制海馬神經元L型鈣離子電流密度，而舒郁膠囊及其有效組分含藥血清則可抑制L型鈣電流密度。Ehlinger等[4]研究表明, 其L型鈣離子通道可以通過色氨酸神經元系統來調控情緒障礙，進一步證實了我們的前期研究。那么PMS肝氣郁證大鼠海馬中 Cav1.2下游的CaMKⅡ/BDNF信號通路是否有變化呢？為進一步驗證舒郁膠囊及主要組份對PMS肝氣郁證大鼠海馬中Cav1.2介導的CaMKⅡ/BDNF信號通路的影響，我們進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Wistar大鼠 130～150 g, 80只, 由山東中醫藥大學實驗動物中心提供[SCXK(魯)2011-0003]。大鼠于晝夜顛倒環境(每日于21∶00開燈, 9∶00關燈)飼養一周, 除實驗期外自由飲食。實驗操作在夜間、暗淡紅燈(星光條件)下進行。

1.2 藥品與主要試劑

舒郁膠囊由白芍、柴胡、香附、甘草有效成分配伍組成(新藥臨床批件2008L11169); 柴胡提取物和白芍提取物，青島陽光海川醫藥科技發展有限公司生產(批號: 2011L06107、20110526和20110527)，是舒郁膠囊的兩種有效成分，其制備方法以及質控指標同舒郁膠囊中該藥物的制備及檢測; 氟西汀，禮來蘇州制藥有限公司(批號H20050463); 尼莫地平德國拜爾醫藥保健有限公司(批號：H20003010)。CaM 一抗(SAB4503194, 美國Sigma公司); CaM-PK II一抗(4436，美國Cell Signal); p-CaMKII (Thr286) 一抗(3361，美國Cell Signal); BDNF一抗(AV41970, 美國Sigma); Tubulin一抗(M2005, Ab-mart)。山羊抗兔二抗(SB200, 遠達晶美); 蛋白Marker(SM0671, Thermo Fermentas),預染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific); Protease inhibitor cocktail(Sigma，P8340)。

1.3 實驗儀器

Olympus顯微鏡(日本Olympus CX41); 大鼠曠場實驗箱 (XR-XZ301, 北京天鳴宏遠科技發展有限公司); SDS-PAGE電泳儀、蛋白印跡轉移裝置(美國伯樂公司); 凝膠成像系統(Syngene, G: BOX chemi XR5)。

1.4 PMS肝氣郁證大鼠模型制備

利用慢性束縛應激法制備模型[5]，曠場實驗篩選得分相近大鼠，陰道涂片鏡檢結合行為學觀察方法確定大鼠動情周期。選擇動情行為規則出現且處于動情周期非接受期的大鼠60只(非接受期相當于人經前期)。按隨機數字表的方法將大鼠隨機分為6組, 分別為正常對照組(簡稱正常組)、PMS肝氣郁證模型組(簡稱模型組)、PMS肝氣郁證模型給予舒郁膠囊組(簡稱舒郁組)、PMS肝氣郁證模型給予柴胡提取物組(簡稱柴胡組)、PMS肝氣郁證造模給予白芍提取物組(簡稱白芍組)、PMS肝氣郁證造模給予氟西汀+尼莫地平組(簡稱氟西汀+尼莫地平組, 陽性對照)。給藥組在造模的同時每日上午8∶30灌胃給藥1次, 直到造模結束。給藥劑量每日分別為0.41 g/kg、0.32 g/kg、36 mg/kg和 2.7 mg/kg(氟西汀和尼莫地平)，均相當于人臨床8倍劑量(柴胡和白芍提取物的劑量設計依據其在舒郁膠囊中所占的比例計算得出)。正常組和模型組大鼠灌胃等體積的滅菌飲用水。造模完成后大鼠斷頭處死，冰上迅速剝離海馬，-70 ℃冰箱備用。

1.5免疫印跡(Western blotting) 檢測 CAV1.2 下游信號通路蛋白表達水平

取出研磨好的大鼠腦組織, 冰浴中操作, 含有非離子型表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚的裂解液(RIPA方法)提取總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒測定樣品蛋白含量。以 50 μg 總蛋白每泳道上樣, 經 SDS-PAGE 電泳分離后，濕法轉移至 NC 膜上, 用含5% 脫脂奶粉的三乙醇胺吐溫緩沖鹽水溶液(TBST)室溫封閉1 h, 分別與一抗(抗-CaM, 1∶800; 抗-CaMKⅡ, 1∶1 000; 抗-pCaMK Ⅱ, 1∶1000; 抗 -BDNF, 1∶1 000; 抗 -Tubulin, 1∶2 000)室溫搖床孵育 2 h(抗體均用5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋), TBST洗膜, 10 min/次,共3次, 再與二抗(1∶2 000) 室溫孵育1 h, TBST洗膜, 10 min/次, 共3次, ECL化學發光試劑檢測雜交信號, 顯影于X線片上, 用掃描儀對X光片灰度掃描, 采用Image J軟件對圖像進行灰密度分析。目的蛋白的灰度值除以內參Tubulin的灰度值以校正誤差, 所得結果代表樣品的目的蛋白相對含量。

1.6 數據分析

利用Xmaze動物行為分析系統(XR-Xmaze)記錄大鼠的曠場試驗得分; 利用GraphPad Prism 5統計軟件統計各組大鼠曠場試驗得分, 數據以表示，采用Image J軟件對圖像進行灰度值分析，One-way ANOVA進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PMS 肝氣郁證大鼠模型制備結果

2.1.1 造模前后行為學觀察實驗前, 各組大鼠均精神狀態為活潑好動，被毛有光澤、眼角干凈、糞便球形。第一天束縛時，模型組和給藥組大鼠表現為強烈反抗、嘶叫、雙目圓睜、毛須豎立、糞便尿液明顯增多; 造模結束后，正常對照組大鼠的狀態與前期相同，模型組大鼠不活躍，表現為精神萎靡，毛發散亂直立、眼神呆滯，大便變稀，扎堆睡覺，反抗能力明顯降低; 解開束縛紗布時，未見對峙，大多跑到角落不動。而給藥組大鼠在被抓時，叫聲較柔和，毛發較整潔，眼角干凈，與模型組相比活動明顯較多。

2.1.2 各組大鼠造模前后體質量

各組大鼠造模前后體質量比較結果見表1, 造模前各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義，造模后, 與正常組相比，模型組大鼠體質量明顯降低(P＜0.001)與模型組相比，舒郁組、柴胡組、白芍組和陽性對照組大鼠體質量顯著升高(P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01;P＜0.05); 與陽性對照組相比，模型組大鼠體質量顯著降低(P＜0.05)。

表 1 造模前后各組大鼠體質量比較 g

2.1.3 各組大鼠曠場實驗得分曠場試驗得分是動物探索行為及興奮性的總體反應，本實驗結果如表2所示，造模前各組大鼠曠場試驗得分無顯著性差別; 造模后，與正常組相比，模型組大鼠曠場實驗得分顯著降低(P＜0.01); 與模型組相比，舒郁組、白芍組、陽性對照組曠場實驗得分顯著升高(P＜0.05)，柴胡組也呈升高趨勢; 與陽性對照組相比，中藥組無顯著性差別，模型組大鼠得分顯著降低(P＜0.05)。

表 2 造模前后各組大鼠曠場實驗得分比較

2.1.4 各組大鼠糖水偏好 糖水偏好實驗結果如表3所示，造模前各組大鼠糖水消耗量無差異無統計學意義; 造模后，與正常組相比，模型組大鼠糖水偏好率呈極顯著性降低(P＜0.001)，與模型組相比，各給藥組大鼠的糖水偏好率有極顯著性升高(P＜0.001); 與陽性對照組相比，模型組大鼠糖水偏好率顯著降低(P＜0.001)。

表 3 造模前后各組大鼠糖水偏好率比較 %

2.2各組大鼠海馬中CaMKⅡ/BDNF信號通路中關鍵蛋白的蛋白及磷酸化水平

從圖1，表4可以看出，與正常組相比，模型組大鼠海馬中CaM蛋白表達量和CaMKⅡ磷酸化水平顯著升高(P＜0.05)，BDNF蛋白的表達量顯著下降(P＜0.01)，各給藥組大鼠差異無統計學意義。與模型組相比, 陽性對照組大鼠海馬CaM蛋白的表達量顯著降低(P＜0.05), 舒郁組、柴胡組、白芍組和陽性對照組大鼠海馬CaMKⅡ磷酸化水平顯著降低(P＜0.01); 舒郁組、柴胡組、白芍組和陽性對照組大鼠海馬，BDNF水平顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)。

3 討論

CACNA1C編碼Cav1.2亞型的α1C亞基，是Cav1.2的主要亞基，作為跨膜的通道蛋白發揮作用, 并且含有二氫吡啶類藥物的結合位點。近年來CACNA1C與情感障礙性疾病的關系研究較多,通過全基因組關聯研究顯示該基因的多態性與抑郁、精神分裂癥、雙向情感障礙性疾病密切相關, 是多種情感障礙性疾病的候選基因之一, 也被認為是未來治療精神情感障礙性疾病的新靶點[6]。本研究在前期研究的基礎上進一步探討了Cav1.2介導的CaM/CaMKⅡ鈣通路與PMS肝氣郁證發生的關系以及調肝方藥的影響。

圖 1 各組大鼠海馬中CaM, CaMKⅡ, BDNF蛋白電泳圖

表 4 各組大鼠海馬中CaM,CaMKⅡ, BDNF蛋白及磷酸化表達水平

有研究表明[7]，鈣離子調節紊亂是PMS的病理生理特征, 并且鈣離子在神經生長中起著至關重要的作用, 皮層發育在很大程度上依賴電壓依賴性的鈣[8]。通過L型鈣通道的電流占細胞總電流的30-50%，此通道的開放與關閉能有效調節細胞漿內鈣離子水平[9]。鈣離子參與突觸可塑性調節[10],PMS大鼠體內鈣離子濃度降低影響突觸可塑性調節, 因此我們認為對鈣離子濃度的調節能夠在PMS病理中起到一定的作用。本實驗中我們利用慢性束縛應激的方法對動情周期處于非接受期的大鼠進行PMS肝氣郁證模型復制，造模完成后根據大鼠的宏觀行為學表現以及曠場試驗和糖水偏好實驗充分驗證了模型復制是成功的。在此基礎上我們檢測了各組大鼠下丘腦中Cav1.2介導的CaM/CaMKⅡ鈣通路關鍵蛋白的表達。實驗結果表明,Cav1.2介導的CaM/ CaMKⅡ在模型組大鼠中關鍵蛋白CaMKⅡ的磷酸化水平是升高的, 而BNDF蛋白表達降低; 造模同時給予舒郁膠囊以及有效組分后大鼠海馬中上述蛋白無異常表達的現象。

CaMKⅡ磷酸化后作用的靶蛋白之一即是CREB，p-CaMKⅡ可使CREB的兩個位點發生磷酸化，這兩個位點分別是Ser133和Ser142, Ser133和Ser142位點的磷酸化分別能啟動和抑制相關基因的轉錄。研究認為CaMKⅡ主要是對Ser142發揮作用。本實驗沒有購買到檢測Ser142位點磷酸化的CREB抗體，所以我們直接檢測了CREB調控的BDNF蛋白的表達。結果顯示模型組BDNF表達降低。這說明CaMKⅡ磷酸化后可能通過對CREB Ser142位點的磷酸化抑制了BDNF的表達，因此結合本實驗我們認為海馬腦區中CaM/ CaMKⅡ的激活與PMS肝氣郁證的發生有關。

舒郁膠囊是臨床治療肝氣郁證的組份配伍新藥，由白芍、柴胡、甘草和香附有效組分配伍而成，臨床療效顯著，其有效成分對中樞神經系統有明顯的調理作用。柴胡是中醫治療肝氣郁結的重要藥物，柴胡皂苷具有抗炎、提高免疫力，抗驚厥的作用，還可以延長睡眠，是治療精神類的疾病有較好的療效[11]。研究認為雌激素和孕激素均可抑制Cav1.2電流[12]，而柴胡皂苷d被認為具有雌激素樣的作用[13]。白芍的主要藥效成分芍藥苷具有促進皮層神經元生長, 保護腦缺血后損傷的作用，可以改善神經行為學癥狀，增加血腦屏障通透性，增加大腦局部血流量。張廣欽等[14]研究認為芍藥苷可以阻斷心肌細胞的Ca v1.2。Wang等[15]發現芍藥苷能通過抑制PC12細胞內CaM/ CaMKⅡ來發揮其神經保護的作用。多項研究[16,17]結果也表明芍藥苷對神經系統的保護作用與抑制細胞內鈣超載密不可分。由此可見，以上中藥配伍既能提高中樞系統的興奮性，又有一定的鎮靜作用，協調平衡中樞系統的功能，其有效成分還可能抑制Cav1.2。因此我們推測Cav1.2信號通路可能是舒郁膠囊的部分作用靶點，白芍提取物和柴芍提取物中的有效成分主要作用至該通路。結合本實驗結果，我們推測調肝方藥可能通過抑制Cav1.2介導的CaM/CaMKⅡ來發揮其治療PMS肝氣郁證的作用。但對其具體作用微觀機制我們還將進一步深入研究。

本研究只是從整體動物水平上得出的結果，在下一步的研究中我們擬在離體細胞水平利用激光共聚焦顯微鏡結合熒光標記以及電生理膜片鉗技術明確舒郁膠囊有效組分提取物或者其有效單體成分對該通道的作用。為該藥物在治療精神情感障礙類等情緒類疾病的應用提供理論基礎。