原花青素對大鼠放射性心臟損傷心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB 蛋白表達的影響

徐興軍, 吳 菲, 宋金熠, 高世樂

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第901醫(yī)院腫瘤四科, 合肥 230031;2. 皖南醫(yī)學(xué)院臨床康復(fù)2班, 蕪湖 241002;3. 安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校臨床5班, 安慶 246052)

胸部放療是肺癌、食管癌、乳腺癌、胸部淋巴瘤和縱隔腫瘤等疾病的主要治療方法之一，據(jù)統(tǒng)計，50%以上患者會在治療的某一階段接受胸部放療[1]。隨著腫瘤診療水平的提高，越來越多的患者可以得到早期診斷，及時治療，極大地提高了生存時間和預(yù)后。同時，腫瘤科醫(yī)師逐漸意識到放療所引起的正常組織損傷，在增加療效的基礎(chǔ)上，盡可能減少放療并發(fā)癥，提高腫瘤患者生活質(zhì)量。心臟位于縱隔，在接受胸部腫瘤放療的同時，會不可避免接受一定劑量的照射，由此引發(fā)的急慢性心包損傷、心肌病、心臟瓣膜功能損傷、心電傳導(dǎo)系統(tǒng)損傷和冠狀動脈損傷等臨床表現(xiàn)，統(tǒng)稱為放射性心臟損傷(radiation-induced heart disease，RIHD)。有研究[2,3]報道，接受胸部放療的患者罹患冠心病、心力衰竭、瓣膜性心臟病和冠狀動脈供血不足的風(fēng)險顯著增加，重者猝死，已成為胸部腫瘤患者非腫瘤死亡首要原因。目前在防治RIHD方面，臨床醫(yī)師除了應(yīng)用適形調(diào)強放療、立體定向放射治療等新技術(shù)，盡量減少心臟等正常組織受量外，尚無有效藥物治療[4,5]，RIHD一旦發(fā)生，無法逆轉(zhuǎn)，因此研究RIHD的發(fā)生機制，早期干預(yù)，防治并重，具有重要意義。中醫(yī)認為，放射之光，為“火熱邪毒”，可導(dǎo)致灼津陰液、又傷氣血、津液涸枯、血氣不和, 以虛、痰、熱、瘀貫穿整個病程, 可給予活血通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰中藥治療[6]。有文獻[7]報道, 藍莓花色苷是原花青素(oligomeric proantho cyanidins, OPC)和糖以糖苷鍵結(jié)合而成的黃銅多酚類化合物, 有促進視紅素再生、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、延緩衰老和提高免疫力等多種藥理作用,且藍莓花色苷可降低心肌組織白細胞介素-1(IL-1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達，減輕放射性心肌損傷[8]，但花色苷極不穩(wěn)定，且純度低，目前研究多停留在粗提取物或體外實驗，提取高效穩(wěn)定的花色苷難度較大，因此需要尋找新的藥物替代。OPC是一類在植物中廣泛存在的多酚類化合物的總稱，天然存在于多種植物的根、葉、花和皮殼中，其中以葡萄籽中含量最為豐富，具有舒張血管、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[9]。OPC是不含糖苷鍵的花色苷，葡萄籽中的OPC含量、清除自由基能力和穩(wěn)定性均高于藍莓花色苷。本文通過建立大鼠RIHD，給予OPC預(yù)防性干預(yù)，檢測治療后不同組別大鼠心肌組織IL-1、TGF-β1和核因子-κB(NF-κB)蛋白表達變化，探討OPC對RIHD的可能作用及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠60只，5～6周齡，體質(zhì)量(200 ± 25) g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(皖)2015-007], 飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實驗室[SYXK(皖)2015-036]。室溫(20 ± 2)℃，相對濕度50% ± 10%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實驗。

1.2 主要藥品及試劑

藍莓花色苷(嘉迪歐公司, 批號: GDL20100224A),OPC(上海阿拉丁試劑有限公司，UV＞95%，批號: D1225014)。IL-1 抗體試劑盒(批號: 201701)、TGF-β1 抗體試劑盒(批號: 201706)和 NF-κB 抗體試劑盒(批號: 201709)均購自美國Sigma公司。

1.3 實驗儀器

直線加速器(美國瓦里安醫(yī)療器械公司，型號VARIN-21EX), 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒公司，型號DHG-9070A)，低溫超速離心機(德國Eppendorf公司，型號Eppendorf 5427 R)，垂直電泳槽及電泳儀(美國Bi o-Ra d公司，型號PowerPac 300)，分光光度計(德國Eppendorf公司，型號BioPhotometer)，電子顯微鏡(北京卓越公司，型號H-301)，Nikon熒光顯微鏡(新飛達光學(xué)儀器公司，型號Nikon ACT-1中文版)，等。

1.4 造模方法[10]及給藥方法

按照隨機數(shù)字分組法將60只大鼠分為正常對照組、單獨照射組、OPC小劑量組(50 mg/kg)、OPC中劑量組(100 mg/kg)、OPC大劑量組(150 mg/kg)、藍莓組(200 mg/kg), 每組10只大鼠。所有大鼠照射前晚禁食禁水8 h, 照射前給予10%水合氯醛0.35 mL/100g腹腔注射全麻，取仰臥位, 頭部及四肢固定在鼠板上, 模擬機定位確定大鼠心臟輪廓, 靶區(qū)面積(2～2.5 cm)×(2～2.5 cm)，單次劑量20 Gy, 源皮距100 cm。OPC組每日分別給予50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg三種劑量灌胃, 藍莓組每日給予藍莓花色苷灌胃, 劑量為200 mg/kg，正常對照組、單獨照射組給予等體積生理鹽水灌胃，放療結(jié)束當日開始給藥，直至放療后4周結(jié)束。給藥結(jié)束后，大鼠經(jīng)麻醉處死，取心臟標本用10%水合氯醛溶液固定備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠心肌組織HE染色[11]大鼠心肌組織用體積分數(shù)10%甲醛溶液固定，依次水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成蠟塊，4 μm切片; 依次脫蠟、水化、HE染色、二甲苯封片，光鏡下觀察心肌及間質(zhì)形態(tài)變化。對心肌組織改變按照Rona標準評分[12]: (1)心肌細胞有無肥大、變性、壞死; (2)間質(zhì)細胞有無充血、水腫、炎癥細胞浸潤、結(jié)締組織增生; (3)心外膜、心內(nèi)膜有無充血、水腫、炎性細胞浸潤。評分分值按照由輕到重分別為0分、1分、2分、3分和4分，0分為正常。

1.5.2 免疫組織化學(xué)法(IHC)[13]檢測IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白采用鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物法(SABC法)，心臟標本蠟塊常規(guī)二甲苯脫蠟、酒精水化、檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)、自然冷卻; 37 ℃溫箱孵育，5%山羊血清封閉，加入Ⅰ抗，4 ℃過夜; 次日復(fù)溫，加入Ⅱ抗，加SABC液, DAB顯色, 蘇木精復(fù)染, 二甲苯透明, 封片，烤干。各心肌組織選取10個視野(×200)，細胞質(zhì)、細胞膜、細胞漿出現(xiàn)淡黃色、棕黃色沉淀為陽性表達。

1.5.3 免疫蛋白印跡(Western blotting)法檢測IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白[14]取各組大鼠心肌組織目標蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用對應(yīng)第一抗體4 ℃搖床孵育過夜, 然后用第二抗體室溫孵育1 h。洗膜后用ECL顯像曝光，采用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)進行內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件分析條帶積分吸光度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以表示，多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織HE染色病理表現(xiàn)和評分

正常對照組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，橫紋清晰，胞質(zhì)均勻，未見斷裂、變性壞死，間質(zhì)未見炎性細胞浸潤(圖1A); 單純照射組大鼠心肌細胞水腫顯著，出現(xiàn)廣泛心肌缺血及心肌纖維壞死，伴有大量炎性細胞浸潤，橫紋消失，核固縮或溶解(圖1B);OPC小劑量組大鼠心肌細胞受損可見，心肌大量小灶性缺血改變及部分心肌小灶性壞死，邊緣中等量炎性細胞浸潤(圖1C); OPC中劑量組心肌細胞受損減輕，心肌小灶性缺血改變及罕見心肌小灶性壞死，心肌組織可見少量正常心肌細胞，邊緣少量炎性細胞浸潤(圖1D); OPC大劑量組心肌細胞受損進一步較輕，心肌組織可見更多正常心肌細胞，細胞排列較規(guī)則，邊緣少量炎性細胞浸潤(圖1E); 藍莓組大鼠心肌細胞受損同OPC小劑量組類似，可見明顯小灶性缺血性改變及心肌小灶性壞死，細胞排列欠規(guī)則(圖1F)。

圖 1 大鼠心肌組織HE染色病理改變 (×200)

各組大鼠HE染色病理評分, 與正常對照組相比, 單純照射組、OPC小劑量及中劑量組、藍莓組病理評分顯著升高(P＜0.01), OPC大劑量組病理評分升高(P＜0.05); 與單純照射組相比, OPC中劑量及大劑量組病理評分顯著升高(P＜0.01), OPC小劑量組、藍莓組病理評分升高(P＜0.05)(表1)。

2.2大鼠心肌組織 IL-1、TGF-β1、NF-κB 蛋白免疫組織化學(xué)表達

與正常對照組相比, IL-1蛋白吸光度值在單純照射組、OPC小劑量組、OPC中劑量組、藍莓組升高(P＜0.05); TGF-β1蛋白吸光度值在OPC小劑量組、OPC中劑量組、OPC大劑量組、藍莓組升高(P＜0.05), 在單純照射組顯著升高(P＜0.01);NF-κB蛋白吸光度值在OPC中劑量組、OPC大劑量組、藍莓組升高(P＜0.05)，在單純照射組、OPC小劑量組顯著升高(P＜0.01)。與單純照射組比較，IL-1蛋白吸光度值在OPC大劑量組降低(P＜0.05); TGF-β1蛋白吸光度值在OPC中劑量組、OPC大劑量組、藍莓組降低(P＜0.05); NF-κB蛋白吸光度值OPC中劑量組、OPC大劑量組降低(P＜0.05)(圖 2 和表 2)。

表 1 大鼠心肌組織病理評分

圖 2 大鼠心肌組織免疫組織化學(xué)染色改變 (×200)

表 2 大鼠心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白平均吸光度值

2.3大鼠心肌組織 IL-1、TGF-β1、NF-κB 蛋白Western blotting表達

與正常對照組比較, 單純照射組、OPC組(小劑量、中劑量、大劑量)、藍莓組大鼠心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB 蛋白表達升高(P＜0.05)。與單純照射組比較, OPC組(小劑量、中劑量、大劑量)、藍莓組心肌組織 IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白表達下降(P＜0.05)(圖3和表3)。

3 討論

心臟位于縱隔位置，當胸部惡性腫瘤接受放射治療時，會不可避免接受電離輻射，造成不同程度放射性損傷，目前認為RIHD發(fā)生機制：放射線破壞內(nèi)皮細胞，內(nèi)腔閉塞，發(fā)生微循環(huán)障礙、心肌缺血，最后導(dǎo)致纖維化; 同時引起組織破壞及淋巴循環(huán)障礙，合用細胞毒性藥物均可加重或誘發(fā)RIHD[15]。1960年代，臨床醫(yī)師已經(jīng)認識到胸部放療可以引起RIHD，因RIHD多處于亞臨床狀態(tài)，需經(jīng)過相當長的潛伏期才出現(xiàn)臨床癥狀，不同部位在不同時間出現(xiàn)病變，未引起足夠臨床重視。急性放射性心包炎發(fā)生于放療期間或放療結(jié)束后；慢性心包炎發(fā)生于放療結(jié)束1年內(nèi);放射性心肌損傷短時間內(nèi)可無明顯臨床癥狀，多在隨訪中發(fā)現(xiàn); 放射性心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)損傷可發(fā)生于放療早期; 放射性瓣膜損傷發(fā)生較晚; 血液學(xué)及病理學(xué)改變較臨床癥狀發(fā)生較早[16]，因此, 早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)顯得尤為重要[17]。本課題組前期通過實驗大鼠模型制備[10]得出單次20 Gy照射大鼠心臟，至第4周末，RIHD發(fā)生。并在前期工作基礎(chǔ)上，對于雄性SD大鼠在放療開始給予原花青素灌胃，觀察RIHD病理改變及相關(guān)細胞因子變化，初步探討RIHD的發(fā)生與細胞因子之間的關(guān)系。

圖 3 大鼠心肌組織Western blotting表達變化

表 3 大鼠心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白相對表達量

近年來，對RIHD的研究主要集中在細胞因子方面，其中IL-1在RIHD的介導(dǎo)中起到一定作用, 當正常組織受輻射后，細胞發(fā)生破裂，IL-1等細胞因子被釋放入血，引起正常組織損傷;TGF-β1在細胞增殖中有雙向調(diào)節(jié)作用，在纖維化過程起關(guān)鍵作用, 在發(fā)生急性RIHD患者明顯高于未發(fā)生急性RIHD患者，參與心肌纖維化起始階段, 在細胞損傷和愈合中有非常重要的地位[18]，同時是器官纖維化的治療靶標。NF-κB是炎癥過程關(guān)鍵調(diào)控因子, 已被證實在RIDH早期會出現(xiàn)NF-κB高表達[19], 那么通過干預(yù)RIHD，能否下調(diào)IL-1、TGF-β1、NF-κB等細胞因子, 目前尚未報道。

本文結(jié)果表明，給予雄性SD大鼠20 Gy單次大劑量照射心臟，放療第4周末結(jié)束時，大鼠心肌組織HE病理染色結(jié)果提示正常對照組大鼠心肌細胞未見明顯異常，單純照射組大鼠心肌細胞出現(xiàn)水腫、心肌缺血、心肌壞死，RIHD形成，OPC各劑量組大鼠心肌細胞損傷較正常對照組明顯，較單純照射組減輕，且隨OPC給藥劑量增加，心肌細胞損傷程度減輕; 藍莓組大鼠心肌損傷改變同OPC小劑量組，心肌細胞HE染色病理評分也支持上述改變。

通過免疫組織化學(xué)及Western blotting兩種不同方法分別檢測大鼠心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白表達情況，結(jié)合HE染色結(jié)果，提示當RIHD發(fā)生時, IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白水平明顯升高, 蛋白表達水平與心肌細胞損傷程度呈正比關(guān)系, 且免疫組織化學(xué)及Western blotting兩種不同方法檢測結(jié)果相一致。給予SD大鼠OPC及藍莓對應(yīng)藥物干預(yù), 在其作用機制可能與心肌細胞受到放射線損傷時, 心肌細胞水腫、缺血、壞死，心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白應(yīng)激性升高, 而OPC具有抗氧化和對心肌細胞具有保護作用，下調(diào)IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白表達,逆轉(zhuǎn)RIHD的發(fā)生有關(guān)。進一步分析OPC及藍莓組不同劑量及藥物之間各細胞因子關(guān)系表明, 隨著OPC劑量增加, IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白水平下降越明顯(P＜0.05), 藍莓組表達水平同OPC小劑量組，說明OPC可防治RIHD且療效優(yōu)于藍莓組，且隨劑量增加，療效越明顯，再次證實了本課題的研究結(jié)果。

綜上所述，當RIHD發(fā)生時，SD大鼠心肌組織IL-1、TGF-β1、NF-κB蛋白表達水平升高，可作為RIHD發(fā)生的判斷指標; OPC可防治RIHD的發(fā)生，OPC中劑量及大劑量組療效優(yōu)于藍莓，為臨床防治RIHD，提供基礎(chǔ)理論支持。