多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染與HIV感染者相關性的研究

龍柳艷,韋曉謀

(廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州545005)

多瘤病毒是正常細胞異常增殖、分化的一類DNA病毒，因其能誘導動物產生腫瘤而得名，其中包括猴多瘤病毒40(SV40)、人多瘤病毒JC病毒(JCV)及BK病毒(BKV)等，多瘤病毒呈全球性分布，在人群中廣泛傳播[1]。2007年，我院研究室調查研究顯示BKV在廣西瑤、侗、苗、壯等少數(shù)民族中存在較高感染率[2]。多瘤病毒感染通常表現(xiàn)為亞臨床癥狀，感染后呈潛伏狀態(tài)終生存在于體內，當感染者免疫功能(主要是T細胞功能)低下或抑制(如妊娠、HIV感染、器管移植等)時可被再度激活，在腫瘤、器官移植受者、HIV感染等免疫缺陷患者可引起嚴重疾病[3]。近年我國HIV感染率與AIDS發(fā)病率明顯上升，廣西艾滋病感染者和艾滋病病人的累計數(shù)在全國排第二位，柳州市又是我區(qū)艾滋病流行嚴重地區(qū)。因此，多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染與HIV感染者相關性成為我們研究的內容。

1 資料與方法

1．1 標本來源于2008-2014年期間，柳州市公安局強制戒毒所，采用確認試驗免疫印跡法(WB)進行HIV篩查，選取HIV感染者為研究組；隨機選取到我院參加健康體檢的健康成人為對照組；各500例，男女各半，年齡不限，收集上述研究對象靜脈血3 ml存于EDTA抗凝管，同時無菌管取新鮮中段尿50 ml。

1．2 儀器及試劑DNA核酸分析儀、DNA電泳儀、Pe5700-PCR儀、日立低溫高速離心機、日立低濕超速離心機旋渦混旋器及凝膠成像系統(tǒng)等分子生物學儀器，BKV-DNA、SV40-DNA、及JCV-DNA定性試劑。

1.3 操作方法(觀察指標、具體操作過程及方法等)

1.3.1具體操作過程 于2008-2012年期間到柳州市公安局強制戒毒所，選取HIV感染者，為研究組；隨機選取到我院參加健康體檢的健康人員為對照組。各500例，男女各半，年齡不限。收集受試者空腹肝素抗凝靜脈血3 ml，尿液10 ml。分離PBLs，將細胞濃度調整為105/ml濃度，200 μl/管分裝，提取基因組DNA。

PCR反應檢測SV40基因：上游引物5′-GCGTGACAGCCGGCGCAGCACCA-3′,下游引物5′-GTCCATTAGCTGCAAAGATTCCTC-3′(由上海申能博彩合成)，反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s ，30個循環(huán)，72℃ 7 min，擴增目的片段為487 bp。取擴增產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，陽性質控標本購自解放軍總醫(yī)院，50 bp DNA Ladder購自申能博彩，結果如下圖1。

M：MARKER；2：陽性對照；3：陰性對照；4-8：HIV感染者；9-12：健康成人

PCR反應檢測BKV基因：PCR擴增BKV-DNA序列，2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR結果，第一次PCR擴增：得到176 bpDNA產物，第二次PCR擴增：得到149 bp的DNA片段，與預期結果一致；結果如下圖2。

1-4：健康成人；5-9：HIV感染者；10：陰性對照；11：陽性對照；M：MARKER

PCR反應檢測JCV基因：上游引物 5′-CCCCATACCAACTTAGCTTTC-3′,下游引物5′-CCAATTTGTAAGGCAGATAG-3′(由上海申能博彩合成)，反應條件為：94℃預變性5 min ，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s ，30個循環(huán)，72℃ 7 min，擴增目的片段為251 bp。取擴增產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，結果如下圖3。

1.3.2觀察指標及方法

觀察指標：在瓊脂糖凝膠電泳中，在相應區(qū)域內出現(xiàn)特異性片段為陽性，無特異性片段為陰性。

觀察方法：全部PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測是否有特異性片段產物產生。

1.3.3結果判斷標準 采用PCR擴增樣本中的多瘤病毒DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，在相應區(qū)域內出現(xiàn)特異性片段為陽性，無特異性片段為陰性(參見《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版)。通過檢測HIV感染者及健康成人對照組血、尿標本中多瘤病毒SV40、BKV及JCV的DNA，檢測其陽性率;并統(tǒng)計分析HIV感染者及健康成人對照組血、尿標本多瘤病毒SV40、BKV及JCV的檢出率及其差別有無顯著性區(qū)別。

M：MARKER；2：陽性對照；3 ：陰性對照；4-8：HIV感染者；9-12：健康成人

1.3.4統(tǒng)計方法 應用PENS 3.1軟件系統(tǒng)分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

采用PCR擴增HIV感染者研究組及健康人員對照組血、尿標標本中的多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA及JCV-DNA，結果顯示：

2.1 HIV感染研究組與健康對照組比較HIV感染組外周血及尿液中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率均較健康成人對照組升高，差異有顯著性意義(P<0.05)，研究結果見表1。

2.2 不同性別組比較HIV感染者與健康成人中男、女不同性別組多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA檢測陽性率，差異無顯著性意義(P>0.05)，研究結果見表2。

2.3 不同年齡組比較HIV感染者與健康成人中18-35歲組、36-55歲組、56-85歲組，三個不同年齡組中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA檢測陽性率，差異無顯著性意義(P>0.05)，研究結果見表3。

表1 HIV感染者中多瘤病毒的感染率

表2 不同性別多瘤病毒的感染率

表3 不同年齡多瘤病毒的感染率(P>0.05)

3 討論

截至2017年10月底，全國累計報告現(xiàn)住址為廣西的存活艾滋病感染者和病人80480例，累計報告死亡43582例。性傳播仍是我區(qū)艾滋病傳播的最主要途徑。2017年1-10月，廣西新發(fā)現(xiàn)報告的艾滋病病例中97%為性途徑傳播，其中異性傳播占91.5%，男男同性傳播占6.27%；50歲以上中老年病例占52.1%；初中以下文化程度的病例占84.5%。截至2018年底，我國估計存活艾滋病感染者約125萬，其中絕大多數(shù)為20-49歲中青年，但60歲以上年齡組所占比例在上升，廣西目前發(fā)現(xiàn)的感染艾滋病年齡最大的年逾90歲。目前對AIDS尚無根治方法，AIDS 患者通常并非因為HIV感染直接致死，而是因為并發(fā)惡性腫瘤和機會性感染或其他疾病而致死。

多瘤病毒是正常細胞異常增殖、分化的一類DNA病毒，因其能誘導動物產生腫瘤而得名，2007年，我院研究室調查研究顯示BKV在廣西瑤、侗、苗、壯等少數(shù)民族中存在較高感染率。當人體免疫功能低下，HIV感染者或移植等患者中，多瘤病毒可再度激活，引起相關疾病。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展及其在醫(yī)學上的應用，對多瘤病毒感染的研究不斷深入，其與人類多種疾病的關系也逐漸明朗。如HIV患者合并JCV相關的進行性多灶性白質腦病(PML)[4]；腎移植后病人并發(fā)BKV相關性腎病(BKVN)[5]等等，目前研究認為多瘤病毒感染和人類多種疾病相關：出血性膀胱炎、間質性腎小球腎炎、輸尿管狹窄、血管病變、肺炎、腦炎、視網膜炎甚至多器官功能衰竭[6]。因此，多瘤病毒SV40、BKV及JCV與HIV相關性也成為我們研究的內容。

我們課題研究組于2008年至2014年期間，在柳州市公安局強制戒毒所選擇抗HIV抗體陽性者為HIV感染組，在我院體檢中心隨機選擇健康受檢人員為健康對照組，分別采集以上兩組研究對象EDTA抗凝靜脈血3 ml及新鮮尿樣標本50 ml各500例，在我院檢驗科PCR實驗室由專業(yè)技術人員進行PCR檢測比較。結果顯示：①多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率，在HIV感染研究組血標本中分別為：20.40%(102/500)、84.20%(421/500)、49.20%(246/500)；在HIV感染研究組尿標本中分別為：14.60%(73/500)、68.40%(342/500)、40.6%(203/500)；在健康成人對照組血標本中分別為：15.20%(76/500)、58.40%(292/500)、30.40%(152/500)；在健康成人對照組尿標本中分別為：9.6%(48/500)、25.20%(126/500)、14.80%(74/500)。②與健康成人對照組相比，HIV感染者外周血及尿液中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA的陽性率均升高，差異有顯著性意義(P<0.05)。③HIV感染者與健康成人中不同性別組、不同年齡組中多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA、JCV-DNA檢測陽性率，差異無顯著性意義。提示多瘤病毒SV40、BKV及JCV在健康人群中存在較高的感染率，多瘤病毒SV40、BKV及JCV的復活與HIV密切相關。

正常人群原發(fā)性多瘤病毒感染常發(fā)生于幼年時，常常無明顯的臨床癥狀，病毒不能完全被機體的免疫系統(tǒng)排除，而潛伏在腎組織和PBLs中[7]。但多瘤病毒抗體對多瘤病毒再次激活并無明顯抵抗作用，當HIV感染者和病人免疫功能下降時，尤其是T細胞功能低下的患者中感染的多瘤病毒可反復激活，其子代病毒開始大量復制，導致腎功能減退乃至腎功能喪失、進行性腦白質病等各種嚴重病發(fā)癥。其中PML的死亡率是其他AIDS相關疾病的10倍[8]，是一種嚴重的致死性疾病。多瘤病毒感染威脅著AIDS病人的生活質量和長期存活，是艾滋病患者的重要死因和并發(fā)癥之一，應引起臨床足夠的重視。另外，對需要多次或長期輸血的艾滋病病毒感染者和艾滋病病人應考慮首選去白細胞血液。因為，以往未感染或獲得多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染的艾滋病免疫缺陷患者，可以通過輸入多瘤病毒陽性白細胞血液而引起感染或再感染，所以對艾滋病病毒感染者和病人應考慮輸入多瘤病毒SV40-DNA、BKV-DNA及JCV-DNA陰性的血液或去白細胞血液，以避免艾滋病病毒感染者和艾滋病病人因多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染或再感染或復活，而引發(fā)的相關性疾病，以更好的降低艾滋病的死亡發(fā)生率。輸血作為傳播多瘤病毒SV40、BKV及JCV的重要途徑之一，應引起醫(yī)務工作者注意。

總之，目前，國內對多瘤病毒感染及其相關性疾病還未引起重視，更缺乏臨床研究，并局限于少數(shù)研究室，國內多瘤病毒研究水平與國際相比差距很大。臨床醫(yī)生和實驗室技術人員對多瘤病毒感染的有關知識如臨床表現(xiàn)、診斷標準、防治措施、檢測技術等相當缺乏，對多瘤病毒醫(yī)院感染的臨床意義沒有給以足夠的重視。2010年世界艾滋病日的主題是：實現(xiàn)“三零”的戰(zhàn)略目標， 即零艾滋病新發(fā)感染、零艾滋病死亡、零歧視。艾滋病因免疫功能低下，機會性感染多，我們通過對HIV感染者及健康成人中多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染陽性率的研究，提示多瘤病毒SV40、BKV及JCV的復活與HIV密切相關。進一步加強多瘤病毒SV40、BKV及JCV感染在HIV感染者中臨床應用的研究是本課題下一步的研究方向。為減少HIV感染者中因感染的多瘤病毒被激活而導致的相關疾病；為延長患者生存期，改善和提高AIDS的臨床治療和研究；為降低艾滋病的死亡發(fā)生率，為實現(xiàn)2010年聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署提出的“三零”戰(zhàn)略目標提供理論依據(jù)；為進一步提高HIV感染者的生活質量、降低醫(yī)療費用，減少家庭及社會負擔，具有不可估量的社會、經濟效益。