腫瘤微環境中CD4+Foxp3+Treg對鼻咽癌患者預后影響

張 勇

(洛陽市中心醫院 耳鼻喉科,河南 洛陽471000)

鼻咽癌為臨床常見一種頭頸部惡性腫瘤，具有種族性、地域性特點，因鼻咽癌經治療后仍存在高復發傾向，對此篩選有效可影響預后因素對提高治療效果具有重要意義，傳統放化療效果有限，目前臨床以特異性免疫治療為探索新方向[1,2]。相關研究指出，免疫功能狀態為影響預后重要因素，其中調節性T細胞作為以免疫調節為主要功能細胞，在機體中發揮維持免疫、預防疾病發生等重要作用，Foxp3分子為T細胞中具有特異性標志分子，輔助性T 細胞17(T helper type 17 cells，Th17)細胞歸為CD4+T細胞亞群，其中IL-17作為主要效應分子起促炎癥作用[3,4]。為探究機體免疫反應與鼻咽癌間的關系，本研究對患者血清以及癌組織中可反映免疫反應的相關指標進行檢測，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年2月-2013年2月于我院收治的127例鼻咽癌患者作為研究對象，病理類型：泡狀核細胞癌29例，未分化鱗癌98例；T分期：T1期32例，T2期35例，T3期31例，T4期29例；N分期：N1期35例，N2期41例，N3a期13例，N3b期38例。納入標準：(1)所有患者均經病理以及影像學檢查首次診斷為鼻咽癌；(2)臨床資料完整且配合檢查；(3)經倫理會批準，患者及家屬簽訂知情同意書。排除標準：(1)嚴重心、肝、腎等功能不全者；(2)免疫系統疾病者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)死于其他疾病以及意外死亡者。依據CD4+/CD8+值有無倒置分為異常組(CD4+/CD8+值<1.0)與正常組(CD4+/CD8+值≥1.0)，其中異常組78例，男41例，女37例，年齡28-63歲，平均(54.28±5.91)歲；正常組49例，其中男27例，女22例，年齡24-66歲，平均(54.16±5.47)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1血清免疫指標監測

清晨空腹抽取患者治療前以及對照組靜脈血3 ml，應用貝克曼流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、Th17在CD4+T細胞比例等指標，試劑盒由B&D公司提供并嚴格按照說明書操作。

1.2.2癌組織標本監測

應用免疫組化雙染法檢測CD4、Foxp3以及IL-17。把組織置于56℃恒溫箱并烘片約30 min，隨后進行常規脫蠟、脫水、抗原修復，PBS清洗3次分別進行滴加Ⅰ抗、Polymer/HRP37℃孵育30 min、滴加顯色劑DAB顯色。PBS清洗5次后分別進行雙染阻斷劑室溫孵育4 min、滴加Ⅱ抗、室溫孵育11 min、Polymer/AP37℃孵育30 min、滴加顯色劑Permanment Red顯色。最后使用蘇木素復染1 min，利用自來水終止顯色并采用鹽酸酒精分化，再次使用蘇木素復染，待晾干后封片。應用雙盲法由3名對病例資料不知情醫師對檢驗結果進行判斷，CD4陽性信號在淋巴細胞胞膜、Foxp3陽性信號在淋巴細胞胞核以及IL-17陽性信號在淋巴細胞胞漿，隨機選取5個不同并具有代表性的視野，在400倍高倍顯微鏡對視野下陽性細胞個數進行計數并取平均值，統計各免疫細胞亞群密度。

1.3 觀察指標

(1)比較兩組患者血清免疫功能指標。(2)觀察CD4、Foxp3及IL-17在癌組織表達情況，并分析CD4+Foxp3+Treg與患者無瘤生存時間、總體生存時間之間的關系。(3)分析CD4+/CD8+異常組與正常組生存率。(4)分析影響鼻咽癌預后因素。(5)分析CD4+Foxp3+Treg與臨床參數間相關性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 CD4+/CD8+正常與異常兩組血清免疫功能指標比較

異常組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Th17在CD4+T細胞比例顯著低于正常組，CD8+顯著高于正常組，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組血清免疫功能指標比較

2.2 CD4、Foxp3及IL-17在組織表達情況

CD4+Foxp3+調節性T細胞多表達于腫瘤間質，其中位數為2.0/HPF，腫瘤癌巢浸潤表達極少，而CD4與IL-17共定位未明確表達(詳見圖1、2)。以ROC曲線建立的CD4+Foxp3+Treg截斷值為0.3，將巨噬細胞分為低表達組(n=45)與高表達組(n=82)。CD4+Foxp3+Treg與患者無瘤生存時間呈顯著正相關(P=0.031)，與總體生存時間呈正相關，但無統計學意義(P=0.271)，詳見圖3，4。

2.3 患者CD4+/CD8+異常組與正常組KM生存率統計

對所有患者進行隨訪5年，CD4+/CD8+異常患者25例死亡，5年總生存率67.95%，正常患者5例死亡，5年總生存率為89.80%，差異具有統計學意義(P=0.034)，詳見圖5。

圖1-2 CD4+Foxp3+ Treg、CD4+Foxp3+TH17細胞分別在鼻咽癌間質中表達

圖3CD4+Foxp3+Treg與無瘤生存時間累積生存曲線 圖4CD4+Foxp3+Treg與總體生存時間累積生存曲線 圖5CD4+/CD8+異常組與正常組生存率比較

2.4 影響鼻咽癌預后因素COX回歸模型分析

以患者無瘤生存時間為因變量，性別、年齡、病理類型、N分期不是影響鼻咽癌預后獨立影響因素，T分期、CD4+/CD8+表達水平以及Th17是影響鼻咽癌預后的獨立影響因素(均P<0.05)，詳見表2。

表2 影響鼻咽癌預后因素COX回歸模型分析

2.5 CD4+Foxp3+Treg與臨床參數間相關性

CD4+Foxp3+Treg與腫瘤轉移復發密切相關，其低表達組轉移復發率44.4%(20/45)顯著高于高表達組的25.6%(21/82)(P<0.05)。而與性別、年齡、T分期、N分期無顯著關系(P>0.05)，詳見表3。

表3 CD4+Foxp3+Treg與臨床參數間相關性

3 討論

鼻咽癌發病部位主要位于鼻咽黏膜被覆上皮，目前關于其發病原因尚未明確，多認為與遺傳因素、吸煙飲酒、EB病毒等因素相關[5]。臨床一般采用放射治療措施，該治療措施具有較好局部控制率，可改善患者臨床癥狀，但因鼻咽位置特殊且較為隱蔽，早期臨床癥狀表現并不明顯，若未及時發現，易導致區域淋巴結轉移與遠處轉移，預后較差，生存質量明顯降低[6]。目前可結合臨床表現、影像學檢查等方式進行鼻咽癌診斷，其中以病理學檢查為主，但仍存在漏診或誤診，基于此，臨床應選擇有效指標以判斷預后，從而采取針對性治療措施，提高患者生存率。

現代腫瘤免疫學顯示，腫瘤發生、發展、轉移等行為不僅與腫瘤細胞所發生分子事件有關，也與腫瘤微環境的生物學環境有關，還可以是腫瘤細胞與腫瘤微環境間相互作用形成[7]。因機體免疫功能低下可促使腫瘤發生發展，同時又可發揮抗腫瘤作用，其免疫狀態是由細胞免疫與體液免疫所決定的，其中細胞免疫反應中的T細胞亞群在抗腫瘤免疫反應中起主導作用，其功能復雜且數量較多，而CD4+與CD8+為反映T細胞亞群主要表面標志，CD4+發揮重要調控作用在整個免疫系統功能中[8，9]。在正常狀態下，CD4+/CD8+比值保持平衡并決定免疫反應總效應，若比值失衡則表明免疫功能處于失調狀態。此外，T細胞中均表達Foxp3分子，其作為叉頭樣核轉錄因子家族成員，位于X染色體，是賦予T細胞免疫抑制功能主要分子[10，11]。T淋巴細胞可以在不同細胞因子影響下劃分CD4+T淋巴細胞亞型，并在TGF-β與IL-6共同存在影響下劃分為Th17細胞，可影響機體免疫穩態[12，13]。大量臨床研究表明卵巢癌、肝癌等部分腫瘤患者外周血、腫瘤組織、轉移淋巴結可檢測到Th17細胞，而關于其在腫瘤中作用的意見則存在差異，部分研究認為Th17細胞發揮抑制腫瘤作用，而有些則認為Th17細胞可促進腫瘤生長，甚至還有人認為其未在腫瘤作用中發揮作用，僅起旁觀者作用。腫瘤微環境是腫瘤細胞與其周邊組織組成，可以為腫瘤生長、侵襲與轉移提供必要基礎[14，15]。因免疫耐受現象存在致使突變細胞未能對免疫監視功能產生反應，可進一步引發腫瘤細胞逃逸。既往研究報道，T淋巴細胞在大部分腫瘤患者的外周血、腫瘤組織的數目與比例呈升高趨勢，并與患者預后相關性較強，鼻咽癌患者的腫瘤組織中也存在大量淋巴細胞浸潤與免疫細胞浸潤，影響疾病發生發展[16-18]。

本研究結果顯示，CD4+/CD8+異常組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Th17在CD4+T細胞比例顯著低于正常組，CD8+顯著高于正常組，提示鼻咽癌患者免疫功能明顯下降，而Th17發揮著積極抗腫瘤作用，其免疫功能失常也可是導致鼻咽癌免疫耐受存在原因之一，推測其原因為腫瘤產生免疫抑制，又受外界因素刺激，并且T淋巴細胞所介導是以腫瘤組織相溶性復合體分子抗原為基礎的抗腫瘤免疫反應，而這一特異反應未能發揮應有作用，從而為腫瘤發生發展提供有利環境，促使病情繼續發展。另應用免疫組化法對鼻咽癌組織中的CD4+Foxp3+Treg與CD4+IL-17+Th17細胞表達水平進行檢測，主要以腫瘤間質中CD4+Foxp3+Treg為主，而CD4+IL-17+Th17較少表達，CD4+Foxp3+Treg與患者無瘤生存時間呈顯著正相關，與總體生存時間呈正相關，但無統計學意義，提示CD4+Foxp3+Treg也可作為臨床判斷鼻咽癌患者預后重要指標，其表達水平越高，無瘤生存時間相應也就越長，在機體中發揮促免疫應答功能作用，因此觀察患者鼻咽原發腫瘤微環境中免疫反應可為判斷患者預后提供可靠參考價值，但本研究因選取病例數較少，仍需對預后進一步觀察。此外，觀察CD4+/CD8+異常狀況對患者的生存情況影響，對患者隨訪5年，其結果顯示，CD4+/CD8+異常患者的5年總生存率67.95%顯著低于正常患者5年總生存率89.80%，提示CD4+/CD8+低于正常者預后效果較差，也證明CD4+/CD8+可作為反映患者預后有效指標，并且在治療前后醫護人員還應當重視對患者免疫功能狀態的觀察，采用可提高患者免疫功能狀態相應治療措施，通過實施免疫調節治療以改善患者免疫功能的恢復。本研究還對影響患者預后情況進行分析，結果顯示T分期、CD4+/CD8+表達水平以及Th17是影響鼻咽癌預后的獨立影響因素，提示臨床應及早對鼻咽癌進行診斷，同時隨時監測機體免疫功能以采取針對性治療措施改善預后。在此次研究中，結果還顯示CD4+Foxp3+Treg與腫瘤轉移復發密切相關，可見其數量的增多在一定程度上可降低局部復發，但關于其是否可以降低死亡率仍需進一步驗證。