低劑量電離輻射對Ⅰ型糖尿病大鼠海馬神經元細胞凋亡和氧化損傷的影響

劉 飛，郭 偉,王志成*

(1.武警吉林總隊醫院第二門診部,吉林 長春130052；2.吉林大學公共衛生學院國家衛健委放射生物學重點實驗室，吉林 長春130021)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成為繼心血管疾病、腫瘤之后的另一個嚴重危害居民健康的重要慢性代謝性疾病，本研究通過鏈尿佐菌素(STZ)藥物誘導Wistar大鼠的糖尿病模型，進而給予低劑量電離輻射(LOR)，探討其抗氧化活性和降低凋亡的作用，為糖尿病腦損傷的保護提供新思路和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

STZ及DCFH-DA(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate)購自美國Sigma公司；血糖儀及配套試紙購自美國強生公司；AnnexinⅤ/FITC試劑盒購自美國BD公司；MDA、SOD和CAT試劑盒購自南京建成生物研究院；β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3一抗購自美國CST公司；X-RAD 320iX生物輻照儀購自美國Precision X-ray公司；紫外分光光度計購自美國Bio-Tek公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠購自吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心，動物合格證號：SXCK(吉)203-2007，實驗前大鼠室內適應環境一周，自由進水、進食，60只雄性大鼠進行造模，造模成功大鼠進行分組。

1.3 STZ誘導糖尿病模型

造模前大鼠禁食12 h，不禁水，造模時按照50 mg/kg進行STZ(10 g/L)左下腹腔一次性注射，注射2 d后檢測空腹12 h尿糖，取尿糖“+++”者再次注射STZ，3 d后取尾靜脈血測空腹12 h血糖，血糖大于16.7 mmol/L，且具有多飲、多食、多尿現象，確定為糖尿病模型。

1.4 實驗分組及處理

正常大鼠10只，以及造模成功的糖尿病大鼠40只，分成正常組、模型組、模型+25 mGy、模型+50 mGy和模型+75 mGy組，每組10只。LDR照射劑量率為12.5 mGy/min，電壓180 kV，電流15 mA，隔日照射，照射12次，繼續實驗4周。

1.5 生化法檢測MDA、SOD和CAT

LDR照射后4周，麻醉后處死大鼠，冰上取出大腦，輕輕剝離海馬，每組4只大鼠的海馬在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入玻璃離心管中，并加入9倍體積的冷勻漿介質，用組織剪將其剪碎，超聲粉碎儀將組織勻漿后分裝在EP管中，制備好的10%海馬組織勻漿，測定蛋白濃度。分別采用MDA、SOD和CAT試劑盒檢測MDA含量、SOD和CAT活力。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡和ROS

3只大鼠海馬放置5 ml 0.01 M PBS中，利用毛玻璃輕輕研磨成單細胞懸液，并經200目尼龍網過濾，1 500 rpm離心5 min后，計數，定容后待測。每組取5×105個細胞，加入450 μl Buffer，2 μl的Annexin V和5 μl的PI；室溫避光染色15 min，流式細胞術檢測凋亡；另取1 × 106個細胞，加入40 μl(20 mmol/L)的DCFH-DA，37℃孵育30 min；PBS洗2次后1500 r/min離心5 min，流式細胞術檢測ROS水平；Cell Quest 軟件分析結果，并以百分率表示。

1.7 Western blot檢測Bcl-2、Bax和caspase-3的表達

此處引用的是《詩經·桃夭》的內容，是一首祝賀年輕姑娘出嫁的詩。這是前半夜唱的敘舊歌，表達姑娘對美好愛情與幸?；橐龅你裤剑氲玫揭粋€如意之人。

每組3只大鼠的海馬，提取總蛋白并進行定量，蛋白變性后每組取25 μg上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時，濃縮膠采用60 V恒壓，分離膠采用120 V恒壓。蛋白轉膜至硝酸纖維膜后，利用新鮮配置的封閉液(1×TBST,5%脫脂奶粉，0.05%的Tween-20)常溫封閉1 h，分別按照1∶1000(β-actin)和1∶500(Bcl-2、Bax和caspase-3)進行一抗孵育，4℃過夜，用含0.05% Tween-20的TBST洗3次，每次10 min，繼而按照1∶1000的辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃震蕩孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，利用ECL發光試劑盒進行發光，X線片曝光顯影，照相后分析蛋白的表達。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 LDR對大鼠血糖水平的影響

造模成功后未進行LDR前，DM和DM+LDR組大鼠血糖水平均高于16.7 mmol/L，且各組間無明顯差異，表明模型為糖尿病模型，可以用于后續研究(表1)。給予25、50和75 mGy照射后2周，血糖繼續增加，且顯著高于Control組(P<0.05)，各劑量組間無顯著差異；照射后4周，DM組血糖水平升高到25.33 mmol/L，LDR各組均顯著低于DM組(P<0.05，表1)；而LDR照射結束后4周，DM組血糖仍維持在高水平，25、50和75 mGy照射組血糖均有下降趨勢，且以75 mGy降低最多。

表1 各組大鼠血糖水平

注：*P<0.05 vs Control group，#P<0.05 vs DM group

2.2 LDR對大鼠海馬神經元細胞氧化損傷的影響

模型大鼠經LDR后4周，檢測海馬神經元細胞ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力，結果顯示，與Control組比較，DM組ROS水平和MDA含量顯著升高(P<0.05，表2)，而SOD和CAT活力未見明顯改變；而給予25、50和75 mGy LDR后，ROS水平和MDA含量則較DM組顯著降低(P<0.05，表2)，且SOD和CAT活力仍處于較低水平(P<0.05，表2)。

表2 各組Wistar大鼠經LDR后ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力

注：*P<0.05 vs Control group，#P<0.05 vs DM group

2.3 LDR對模型大鼠海馬神經細胞凋亡百分比的影響

流式細胞術結果顯示(圖1)：海馬神經細胞凋亡百分比Control組為(6.85±0.75)%、DM組為(28.51±2.47)、DM+25 mGy組為(18.56±2.66)%、DM+50 mGy組(14.83±1.59)%和DM+75 mGy組為為(13.88±2.98)%；與Control組比較，DM和DM+LDR組凋亡百分比均顯著增加(P<0.05)，與DM組比較DM+LDR組凋亡百分比則顯著降低(P<0.05)。

2.4 LDR對大鼠海馬神經元細胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達的影響

模型大鼠經LDR后4周，檢測海馬神經元細胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達，由圖2可見，DM模型組Bcl-2表達降低，而Bax和caspase-3均增加，暗示凋亡的增加；而DM大鼠經LDR后Bcl-2表達增加，而Bax和caspase-3表達則降低，暗示LDR降低了DM大鼠海馬神經元細胞的凋亡，與流式結果相似。

圖1 利用AnnexinⅤ/FITC試劑盒流式細胞術檢測Wistar大鼠海馬神經元細胞的凋亡

圖2 Western blot檢測Wistar大鼠海馬神經元細胞Bcl-2、Bax和caspase-3的表達

3 討論

STZ誘導的糖尿病模型大鼠高血糖在大腦各個區域神經的降解起到重要作用，包括扣帶回皮質、丘腦核和海馬體，主要和ROS的產生有關[1]。海馬體對近期主要記憶具有重要作用，并將其存入大腦皮層轉變成永久記憶。海馬體在記憶和學習中的重要作用已經得到充分的認識，海馬受損的患者記憶力明顯下降，并可能患有焦慮癥。研究表明，糖尿病時葡萄糖對神經的毒性作用也是因為增強細胞內葡萄糖的氧化進而導致ROS產生的增加[2]。在本研究的動物模型中，海馬神經元細胞ROS水平和MDA含量均顯著高于正常組，暗示糖尿病模型處于氧化損傷狀態。另外，氧化應激損傷細胞可以誘導凋亡，研究表明糖尿病時海馬細胞由高血糖誘導的凋亡是海馬損傷的一個重要途徑[3,4]。而且在凋亡過程中，凋亡的線粒體調控途徑涉及到持續的高血糖狀態可以產生過量的ROS，使得線粒體膜電位及滲透性發生變化，膜通透性轉運孔開放，膜去極化，使得線粒體內促凋亡因子釋放到細胞漿中，激活caspase-3，引發級聯反應，從而誘發凋亡；另外，Bcl-2/Bax對于調控膜的通透性具有重要的作用[5]。本研究所構建的糖尿病大鼠模型中，海馬神經細胞凋亡顯著增加，且Bcl-2表達降低、Bax和caspase-3表達增高，暗示相應的線粒體通路被激活。

長期的高血糖會導致嚴重的并發癥，針對性治療可以有效緩解相應的并發癥。研究者利用番茄紅素(lycopene)治療糖尿病大鼠模型，結果顯示可以降低氧化損傷，并且降低氧化應激導致的外周炎癥和認知損傷的發展，而且也能降低線粒體途徑介導的細胞凋亡[6,7]。由此可見，以降低氧化損傷為目的的糖尿病神經損傷將具有重要的意義。低劑量電離輻射是單次照射劑量小于0.2 Gy，劑量率控制在0.05 Gy/min以內的劑量[8]。以往研究顯示可通過誘導抗氧化活性對大腦進行保護作用，且LDR對大腦不具有損傷效應[9,10]。在本研究中，25、50和75 mGy的LDR對糖尿病模型大鼠的血糖具有一定的控制作用，但并未達到完全逆轉的效果。而且，也降低DM大鼠海馬ROS水平和MDA含量，暗示可以降低氧化損傷，未能顯著提高抗氧化能力。同時，也降低了DM大鼠海馬神經元細胞凋亡和線粒體途徑相關分子的表達。由此可見，LDR可以通過降低氧化損傷、抑制凋亡的誘導，從而發揮控制血糖的作用，有可能是一個較好的糖尿病腦并發癥控制的新思路。

總之，本研究通過STZ建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并給予LDR照射治療，結果顯示糖尿病大鼠海馬的氧化損傷和凋亡誘導增加，且LDR具有一定的緩解作用，這為LDR控制糖尿病腦損傷的研究提供了必要的實驗證據。