VEGF表達下調抑制人宮頸癌細胞增殖轉移相關機制研究

史愛英

(錦州市中心醫院 婦產科,遼寧 錦州121000)

宮頸癌(CC)是嚴重威脅婦女健康和引起婦女死亡的主要原因[1]。研究發現VEGF在調控腫瘤血管生長、浸潤、轉移中發揮關鍵作用[2,3]。本研究中，通過建立CC細胞株，并通過干擾VEGF表達，檢測VEGF下調對CC細胞的存活及凋亡的影響，從而進一步深入探索VEGF在CC發病中扮演的角色，為臨床開發更加高效合理的治療方案奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與分組

人宮頸癌Hela細胞株購自北京中國醫學科學院腫瘤研究所。根據已有方法[4]，將HeLa細胞培養于培養基中，然后置于CO2培養箱中培養。選對數生長期細胞，將其隨機分為2組：Control組(只加Lipofectamine)，VEGF干擾組(給予VEGF-siRNA處理，si-VEGF組)。將細胞接種于96孔板(密度為4×103/孔)，并根據lipofectamine RNA imax說明書對細胞進行轉染。

1.2 劃痕實驗

轉染后24 h，用200 μl槍頭在兩組細胞分別制造均勻劃痕。經PBS漂洗后置于培養基中培養。于培養0 h和24 h，分別檢測各組劃痕。

1.3 CCK-8試驗

將穩定感染后的兩組細胞接種于96孔板，并設置6個復孔。于細胞培養后不同時間點(12 h、24 h、36 h、48 h和72 h)，在各組細胞分別加入CCK-8試劑(10 μL/孔)后繼續培養4 h。然后，通過酶標儀檢測450 nm波長處各孔OD值。

1.4 蛋白免疫印跡實驗(Western blot assay)

取VEGF干擾后48 h的Control組和si-VEGF組細胞，根據BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)說明書分別提取各組細胞總蛋白，并檢測蛋白濃度。通過SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉后加入一抗(Bax,1:500，購自Abcam公司;Bcl-2,1:1000，購自Abcam公司)，4 ℃過夜。其后， PBS漂洗后加入二抗，并室溫孵育1 h。最后，采用Bio-Rad 凝膠成像系統( GEL DOC EZ IMAGER，Bio-rad，California，USA)進行曝光，并使用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析。

1.5 統計學方法利用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計學分析。兩樣本采用t檢驗，P<0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 VEGF干擾對Hela細胞遷移的影響

為了探索VEGF干擾對Hela細胞遷移的影響，我們在細胞干擾后實施了細胞劃痕實驗，并且于劃痕后0 h和24 h分別進行拍照。實驗結果顯示，轉染24 h后Control組劃痕因細胞遷移明顯變窄(圖1 A-B)，而si-VEGF組劃痕仍保持較寬水平(圖1 C-D)。

2.2 VEGF干擾對Hela細胞增殖的影響

CCK-8試驗檢測結果顯示，細胞培養后36 h si-VEGF組細胞活性低于Control組，但無統計學差異(P>0.05,圖2)；細胞培養48 h和72 h，si-VEGF組細胞活性均明顯低于Control組(P<0.05,圖2)。

圖1 VEGF干擾抑制Hela細胞遷移

(A,C)顯示Control組和si-VEGF組劃痕后0 h細胞情況；(B,D)顯示Control組和si-VEGF組劃痕后24 h細胞遷移情況。

圖2 VEGF干擾抑制Hela細胞增殖

Control組只加入Lipofectamine，si-VEGF組給予VEGF-siRNA處理。*P<0.05，與Control組比較。

2.3 VEGF干擾后對細胞Bax/Bcl-2蛋白表達的影響

為了檢測VEGF干擾對Hela細胞Bax/Bcl-2蛋白表達的影響，我們通過蛋白免疫印跡實驗分別檢測VEGF干擾后48 h Control組和si-VEGF組Bax/Bcl-2蛋白表達水平。結果表明，與Control組比較，si-VEGF組Bax蛋白表達明顯增加(P<0.05,圖3A,C)，而Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05,圖3B,D)。

圖3 VEGF干擾對Hela細胞Bax/Bcl-2蛋白表達的影響

(A,C)顯示VEGF干擾后Control組和si-VEGF組Bax蛋白表達水平；(B,D)顯示VEGF干擾后Control組和si-VEGF組Bcl-2蛋白表達水平。*P<0.05，與Control組比較有統計學差異。

3 討論

CC是導致發展中國家婦女死亡的主要原因[5，6]。研究發現誘發CC的主要因素包括人乳頭瘤病毒感染[7]、吸煙、年齡過早的性交、性伴侶數量過多和慢性免疫抑制等[8]。目前，手術、放/化療是治療CC的主要方法[9]。然而，由于CC的臨床癥狀和體征直到癌癥晚期才出現，因此導致CC治療效果較差。因此，找到一種更加合理、高效的檢測方法和治療靶點，是提高CC患者預后，減少CC死亡率的有效方法。

腫瘤的生長和轉移必須依賴豐富的營養供給，而血管生成是營養物質運輸的重要條件[10]。研究表明，VEGF能促進腫瘤血管內皮細胞增殖、侵襲和血管形成，從而加速腫瘤形成和轉移[11-13]。Saharinen P指出VEGF能夠改變淋巴管內皮黏附特性，增加細胞/趨化因子分泌，從而促進腫瘤細胞增殖[14]。Fujimoto J等發現VEGF高表達能夠促進CC患者淋巴結轉移，導致患者預后較差，生存率明顯降低[15]。在本實驗中，我們發現VEGF干擾后表達下調能明顯抑制CC細胞的增殖和轉移，該實驗結果與過去研究結論相符。本研究進一步證明了VEGF在CC中同樣發揮重要作用，是促進CC增殖和轉移的關鍵因素。此外，VEGF干擾后Bax蛋白表達上調和Bcl-2蛋白表達下調也證明VEGF的表達與凋亡相關蛋白密切相關。綜上所述，本實驗研究將有助于進一步深入闡明VEGF在CC中的相關分子機制，為臨床開發新的治療靶點和制定更加合理有效的治療方案提供更好的理論支持。