哈爾濱市動物源性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

姜慧宇,魏 娜

(吉林大學第一醫院 第一手術室,吉林 長春130021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SAU )有較強致病性，具有分布廣、傳播途徑多樣的特點。近年來由于廣譜抗菌藥物的亂用及濫用，SAU耐藥性不斷增強，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)成為多重耐藥醫院感染最常見的革蘭陽性菌，是醫院感染重點監測對象[1]。金葡菌感染可以引發多種疾病，包括皮膚和軟組織感染(SSTI)、肺炎、心內膜炎、菌血癥和敗血癥[2]。該病原體還可引起反芻動物(牛、綿羊、山羊等)、家禽和豬的大規模感染[3]。為了對哈爾濱市動物源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況做一個大體性調查，以便后續的耐藥機制、傳播規律及與人型菌株的關系研究，在哈爾濱部分地區的養殖場分離鑒定了部分金黃色葡萄球菌，并測定了這些菌株對臨床常用抗菌藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理所有樣本于 2017年 6 月至 8月采集于南崗區1個養雞場(養雞場1)、1 個養豬場(養豬場1)，香坊區 2個養雞場(養雞場 2，養雞場3)、1個養豬場(養豬場2)和1 個養牛場(養牛場 1)，五常市1個養雞場(養雞場 4)和1個養牛場(養牛場2)， 賓縣1個養豬場(養豬場3)。對動物糞便樣本進行采集，用無菌棉簽取 0.3 g 左右的糞便盛于1.5 ml滅菌離心管；所有采集的樣本均置于車載冰箱中，12 h之內進行處理。在每個裝有樣本的離心管中加入1 ml無菌生理鹽水震蕩后靜置2 h以釋放細菌，再次震蕩混勻后吸取 0.2 ml液體于 Mueller-Hinton 高鹽培養基中培養8 h。每個平板挑取 1-3個淺黃色或黃色的疑似金黃色葡萄球菌菌落劃線于 NB固體平板，37 ℃培養12 h后進行革蘭染色觀察細菌形態。

1.2 PCR檢測根據王豪舉[4]等學者的文獻，合成特異性引物，上游引物為F：5′-A G GGAT GGC TATC AGTAATGTTTC- 3′，下游引物為R：5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′。PCR 反應體系：2×Taq Master Mix 10 μl，F(10 μmol/L)0.5 μl，R(10 μmol/L)0.5 μl，模板 0.5 μl，ddH2O 8.5 μl，總反應體系20 μl。PCR 反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，共30 個循環；最后 72 ℃延伸 6 min。反應結束后取 5 μl反應產物經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果。

1.3 藥敏試驗分離的菌株對22種抗菌藥物的敏感性用紙片法進行測定。測定結果參照《動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執行標準(2013版)》、《抗菌藥物敏感性試驗執行標準；第二十三版資料增刊》進行判定，具體操作方法參照張倩[5]與楊延成[6]等學者的方法。

2 結果

2.1 菌株分離結果將平板上疑似為金黃色葡萄球菌的菌落經 PCR 擴增后，最終共鑒定出17株金黃色葡萄球菌(圖 1)，包括 10株雞源菌株(泳道 1-10)、6株豬源菌株(泳道 12-17)，1株牛源菌株(泳道 18)。在南崗區共分離5株金黃色葡萄球菌，其中養雞場1 分離雞源菌株 3 株， 記為1-3 號菌， 養豬場1分 離豬源菌株 2株，記為4，5號菌； 香 坊 區共分離7株金黃色葡萄球菌，其中養雞場2分離雞源菌株1株，記為6號菌，養雞場3分離雞源菌株2株，分別記為7號及8號菌；養豬場2分離豬源菌株3株，記為9-11號菌；養牛場1分離牛源菌株1株，記為12號菌。在五常市共分離4株金黃色葡萄球菌，均來自養雞場4，記為13-16號菌。在賓縣養豬場3分離一株豬源菌株，記為17號菌(表1)。

圖1 17株臨床分離株的PC R 鑒定結果

表1 金黃色葡萄球菌樣品采集及菌株分離

2.2 耐藥性分析17株臨床分離株動物源性金黃色葡萄球菌的藥物敏感性試驗結果見表2和表3。實驗結果顯示，所分離的17株金黃色葡萄球菌中14株對青霉素G耐藥，耐藥率為76%；對慶大霉素及頭孢拉定耐藥的菌株均為 10株 ，耐藥率均為59%；對阿莫西林、鏈霉素及紅霉素耐藥的菌株均有8株，耐藥率均為47%；對大觀霉素、阿米卡星、思諾沙星、乳酸環丙沙星及磺胺異惡唑等五種抗菌藥物耐藥的菌株均為7株，耐藥率為41%；對氨芐西林、卡那霉素、氧氟沙星、復方新諾明、呋喃唑酮、四環素及強力霉素等7種藥物耐藥的菌株數均為6株，耐藥率為35%；對諾氟沙星、林可霉素和萬古霉素耐藥的菌株數均為5株，耐藥率為29%；對氯霉素耐藥的菌株數最少，僅為4株，耐藥率為24%。分離自南崗區的3株雞源菌株對青霉素G和頭孢拉定耐藥；2株豬源菌株對頭孢拉定和鏈霉素耐藥。

分離自香坊區的3株雞源菌株對青霉素G耐藥，且對復方新諾明表現敏感；3株豬源菌株對頭孢拉定耐藥，且對氧氟沙星和林可霉素較為敏感；一株牛源菌株對9種藥物耐藥。分離自五常市的4株雞源菌株對慶大霉素、復方新諾明及林可霉素的耐藥率高達75%。分離自賓縣的1株豬源菌株對22中常用藥中的10種耐藥。

所有菌株的實驗結果顯示，β-內酰胺類的抑菌效果較差，細菌在該類藥物中產生的耐藥性較高；氨基糖苷類藥物的抑菌效果較β-內酰胺類藥物略顯優勢，17株菌株中對該類藥物耐藥的數量較前者少；氯霉素類藥物(本實驗特指氯霉素)的抑菌效果最好，菌耐藥率為24%，17株菌中僅四株對該藥顯示耐藥性。不同動物來源的菌株對藥物的耐藥性并未顯示出明顯偏好性，但雞源菌株的耐藥性明顯高于豬源和牛源的菌株，牛源菌株的耐藥性普遍較前兩者低。多重耐藥菌株的耐藥特性從5種到13種不等，分別為5種、8-13種。多重耐藥多集中在9種-11種。8種、12種及13種均只有1株菌，5種和 9種各有2株菌，11種有3株菌，10種均有6株菌。10種及以上的菌株數占所有分離菌株數的65%。

表2 17株臨床分離株的抑菌圈直徑及藥物敏感性結果

A無NCCLS 標準，敏感度判定參照頭孢唑啉;B無NCCLS 標準，敏感度判定參照阿米卡星;C無NCCLS 標準，敏感度判定參照氧氟沙星;D無NCCLS 標準，敏感度判定參照呋喃妥因;E無NCCLS 標準，敏感度判定參照阿奇霉素。

3 討論

某些抗生素類藥物在國家已經禁止使用的情況下，某些分離菌仍顯示較高抗性，與養殖場的飼料及環境不無關系[7]。分離菌株對青霉素G的抗性較其他藥物明顯強，可能與養殖場日常感染的常用藥有關。不同動物源性菌株對藥物的敏感性亦存在一定差異，如豬源菌株對頭孢拉定的耐藥率高于雞源菌株，這可能是由于頭孢拉定作為養豬場預防用藥有關。由于牛源細菌分離獲得菌株數較少，在此不作討論。

金黃色葡萄球菌是人類臨床上重要的病原菌之一，是導致血液感染、心內膜炎等的元兇之一，由金黃色葡萄球菌引起的致病率和死亡率有連年增高的趨勢，金黃色葡萄球菌作為一種致病菌正嚴重威脅著人類的健康發展[8]。在臨床上，金黃色葡萄球菌的耐藥現象正日益加劇，以對甲氧西林耐藥為代表的金黃色葡萄球菌(MRSA)，為控制金黃色葡萄球菌性疾病的流行、傳播和臨床治療帶來了極大挑戰，MARA也被稱為“超級細菌”[9]。金黃色葡萄球菌致病的主要機制是釋放毒素，可引起機體出現非特異性炎癥反應，并引起嚴重的敗血癥，最終導致死亡。目前金黃色葡萄球菌研究較多的毒力因子有：血漿凝固酶、Pantone-Valentine(PVL)殺白細胞素、中毒性休克素I(TSST-I)、金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)等[10]。

表3 分離菌株對抗生素的耐藥情況

本實驗涉及哈爾濱及周邊地區，范圍較廣，共采集550份樣本，分離并檢定獲得104株細菌，經進一步測序及BlastN比對，共確定17株金黃色葡萄球菌， 分離率為3.1%，樣本的總分離率較高，但由于距離原因，某些樣本處理不夠及時，也造成分離菌株數量的一定誤差。本實驗僅對分離獲得的細菌耐藥性進行初步討論，針對細菌的耐藥機制并未進行深入討論，下一步將會針對不同來源的細菌耐藥性原因做進一步研究討論，并進行統計學分析。