轉基因動物模型在哮喘疾病診斷中的應用展望

潘 赫，谷奕諾，左 旭，鄭敬彤

(吉林大學基礎醫學院 病原生物學教研室，吉林 長春130021)

哮喘是一種常見慢性氣道炎癥，由于無法預防或完全治愈嚴重威脅著社會經濟和人類的身體健康[1,2]。據GHDx數據庫統計(http://ghdx.healthdata.org/)，1990年至2012年全球哮喘病死亡人數顯著下降，死亡率也由1.3%下降至0.83%。但由于多方面的復雜因素如哮喘的耐藥性，新過敏原等問題導致近幾年因哮喘而死亡的人數有上升趨勢，嚴重威脅著人們的身心健康，已成為當前危害公共健康的主要疾病之一(圖1)。哮喘的規范化管理和防治近年受到了普遍關注，哮喘管理和防治的全球策略已在大多數國家推廣應用。但目前上海、北京的調查結果顯示我國哮喘防治水平與歐美發達國家仍有較大差距，哮喘的控制率仍很低。

哮喘疾病的產生是一個十分復雜的過程，其中，變應性氣道炎癥 (AAI) 作為典型的哮喘病理基礎，具有氣道反應性高、氣道炎癥反應明顯、黏液分泌增多、氣道重塑等主要特點[3,4]。如果以患者作為實驗對象研究疾病的發生機制，過程十分緩慢，而且許多實驗在倫理上和方法上也受到限制，局限性很大。通過轉基因動物模型進行間接研究可以人為控制各類影響因素，同時也回避了人體實驗所帶來的不良影響，能更有效研究動物模型的實驗結果與人類疾病之間的異同，有助于更清晰有效地認識人類疾病的發生、發展規律，為探索哮喘發病機理、提出新的診斷方法以及補充新的診斷依據提供了模型基礎[5]。

本文將從哮喘診斷的常規方法以及轉基因動物在哮喘疾病診斷上的應用前景兩方面進行描述，闡明轉基因動物模型對哮喘疾病診斷的應用前景，將對指導合理診斷、有效地選擇臨床用藥，具有切實的意義。

A.1990年至2018年全球因哮喘導致死亡的人數； B.1990年至2018年全球哮喘患者死亡率

1 哮喘的常規診斷方法

根據中國《支氣管哮喘防治指南(2016 年版)》[6]，支氣管哮喘診斷要點主要包括典型的哮喘臨床癥狀和體征以及可變氣流受限的客觀檢查等。在符合上述癥狀和體征的同時具備氣流受限，即可診斷為支氣管哮喘。通過分析支氣管哮喘防治指南可以看出，支氣管防治主要以患者實際體征出發，而較少提及高危人群的基因篩查診斷，以及利用基因差異進行疑似患者的跟蹤隨訪等。

2 轉基因動物模型的診斷前景分析

由于轉基因動物具有可復制性、可控性、縮短實驗周期、有助于全面認識疾病的本質的特點，已經逐漸成為研究人類疾病的發展規律以及疾病防治機理的重要工具之一。 其中Nrf2、IL-35、 HLA-DR、IL-33等轉基因模型在哮喘中影響如下。

2.1 Nrf2基因缺陷鼠

研究表明，Nrf2基因缺陷鼠在哮喘造模后，氣道更敏感，氣道高反應性更明顯，肺泡灌洗液中，炎性因子和炎性細胞數量明顯增多，提示Nrf2缺陷鼠能較好的模擬哮喘的發生發展[7,8]。此外，研究者通過體外建立姜黃素干預哮喘Balb/c小鼠模型以及體內建立姜黃素干預小鼠巨噬細胞RAW264.7模型[9]，結果顯示姜黃素能激活哮喘小鼠肺組織及RAW264.7細胞的Nrf2及HO-1的表達與含量，并調整Nrf2與ARE的結合活性。此外，高脂蛋白通過激活Nrf2信號通路也能改善OVA誘導的過敏性氣道炎癥[10]。因此，Nrf2基因的表達情況對未來建立的哮喘患者診斷標準可能具有十分重要的作用，可通過獲取患者血液或者組織標本后對Nrf2基因情況進行鑒定，從而達到對高危人群進行基因篩查的目的。

2.2 IL-35過表達轉基因小鼠

IL-35是最新發現的IL-12細胞因子家族成員，是由EBI3和IL-12p35兩個亞基組成的異二聚體。其中EBI3由EB病毒感染的B淋巴細胞誘導產生，編碼為34 kDa的糖蛋白，與IL-12p40有27%的氨基酸同源性[11]。而IL-12p35通過抑制淋巴細胞增殖，誘導B細胞中IL-10表達和IL-35表達的增加，并能通過對抗Th17致病性反應改善小鼠自身免疫性葡萄膜炎[12]。修晶輝[13]利用酶切回收pCMV6-XL5-h-IL35片段并克隆入質粒中，構建IL-35過表達轉基因小鼠，再用OVA刺激誘導的哮喘模型來研究IL-35在變態反應中抑制炎癥發生的作用及其免疫調節機制。研究表明IL-35通過促進Treg細胞增殖抑制細胞因子IL-17分泌的途徑抑制哮喘炎癥的發生和粘液的分泌，具有明顯的抑制哮喘的作用。因此，如果成功構建了高危人群基因篩查診斷庫，IL-35基因過表達患者在基因篩查的時候應格外引起重視。

2.3 HLA-DR2和HLA-DR3轉基因小鼠

HLA-DR是MHC-II類分子，表達于B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、活化T淋巴細胞和活化NK淋巴細胞表面上。研究表明HLA-DR系列基因與哮喘及其相關表型有關[14,15]。Rajagopalan,G等[16]為了擴展這一觀察并證明這種關聯，通過使用室內塵螨提取物對HLA-DR2和HLA-DR3轉基因小鼠進行刺激致敏，比較HLA-DR3、HLA-DR2轉基因小鼠和正常小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞計數和細胞因子水平之間的差異。 研究顯示皮下增敏后再接受塵螨提取物鼻腔刺激的轉基因小鼠，其肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞以及IL-4和IL-13會顯著升高。結果表明，攜帶HLA-DR2和HLA-DR3基因的轉基因小鼠能夠通過抗原特異性T細胞誘發炎癥反應。 因此，HLA-DR基因對哮喘患者基因診斷標準的建立可能具有一定的輔助作用。

2.4 IL-33和ST2缺陷轉基因小鼠

IL-33屬于IL-1細胞因子家族，通過ST2膜受體誘導Th2免疫應答，在調節免疫系統中發揮重要作用[17,18]。上皮細胞是IL-33的主要產生者，然而骨髓細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和肥大細胞等其他細胞也可分泌。例如，IL-33靶向的細胞類型廣泛攜帶ST2表面受體。許多ST2陽性細胞，如Th2細胞、肥大細胞、嗜堿性細胞和嗜酸性細胞，參與了哮喘的發展，提示IL-33直接參與哮喘發病機制[19,20]。目前，針對單克隆抗體在哮喘小鼠模型中阻斷IL-33及其受體已經進行了相關實驗，IL-33和ST2缺陷轉基因小鼠也已經構建成功[21,22]。研究結果提示IL-33和ST2基因突變可能對哮喘患者的Th2免疫應答起重要作用。

3 小結和展望

哮喘患者在早期發病時癥狀不明顯甚至無癥狀，導致臨床工作中很難對哮喘進行預防診斷，而基因的診斷可能會為哮喘的預防以及診斷提供了很好的方向。本文通過探討Nrf2、IL-35、 HLA-DR、IL-33等轉基因模型對哮喘嚴重程度以及表型的影響，分析了上述基因對建立患者篩查以及診斷標準的重要性。通過分析基因表達情況可以有效篩查出易患病的高危人群，可及時對潛在的哮喘患者進行隨訪，做到早預防、早診斷、早治療，對哮喘的輔助診斷具有重大意義。