α-平滑肌肌動蛋白在呼吸道合胞病毒感染小鼠肺組織中的表達及意義*

盧飛艷，蔣鐵漢，宋文秀

遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院(珠海 519100)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是人類呼吸道感染的重要病原體之一，是嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病因，也在兒童支氣管哮喘的急性發作中起著重要作用[1]。大量臨床研究證實，嬰幼兒時期患RSV毛細支氣管炎(以下簡稱毛支炎)與兒童時期患支氣管哮喘密切相關[2]。RSV毛支炎與哮喘患兒體內存在共同的炎性細胞因子紊亂，即RSV毛支炎與哮喘在發病機制上具有極強的相關性[3]。

越來越多證據表明，RSV感染和支氣管哮喘的發生具有密切的關系，氣道炎癥和氣道重塑是哮喘發病的兩個重要的病理學特征，機體反復出現持續的氣道炎癥，一定程度上會讓氣道的相關組織學結構發生改變，從而導致氣道重塑，而機體出現氣道重塑是影響哮喘臨床治療效果的重要因素之一[4-5]。α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)是氣道平滑肌細胞的特征性標志物，正因為α-SMA的表達與哮喘氣道重塑關系密切，α-SMA已被認為是反映哮喘氣道重塑的重要指標[6]。本文通過檢測α-SMA在RSV感染小鼠肺組織的動態表達，觀察α-SMA在RSV感染后肺組織的變化，探討α-SMA是否參與了RSV感染小鼠的發病過程。

材料與方法

1 材 料 48 只健康雌性BALB/c 小鼠(15～20 g，4周齡，購自廣東省動物實驗中心)；水合氯醛、4%多聚甲醛購自上海寶曼生物公司；RSV A2株購自廣州博特生物科技有限公司；Masson三色染色試劑盒購自南京森貝伽生物有限公司；α-SMA兔抗小鼠一抗抗體、SABC免疫組化試劑盒、PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液均購自武漢博士德生物技術有限公司；無水乙醇、伊紅染液、Harris 蘇木精染液均由遵義醫科大學珠海校區病理教研室提供。

2 實驗方法

2.1 動物分組:查閱參考文獻[7]中關于RSV感染小鼠模型的制備方法進行。48只體重 15～20 g的雌性 BALB/c小鼠，按照完全隨機法將小鼠分為兩組(每組 24 只)：對照組(生理鹽水組)和觀察組(RSV感染組)。感染組小鼠予行腹腔注射麻醉，然后經鼻腔滴入100 μl 106PFU的RSV；對照組小鼠予相同方法麻醉后，經鼻腔滴入相同劑量的生理鹽水；分別在四個時間點(第 4天、第8天、第14天、第28天)處死小鼠(每個時間點生理鹽水組和觀察組各6只)。

2.2 取材及制片:將已處死的小鼠左主支氣管及左肺分離出，切下左肺后固定于4%多聚甲醛中。

2.3 小鼠肺組織HE染色:將固定的左肺24 h 后取出，分取小塊肺組織，常規梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋、切片，展平固定于玻片上，干燥，脫蠟、梯度酒精直至蒸餾水，HE染色，封片，光鏡下觀察支氣管-肺組織病理改變。

2.4 小鼠肺組織Masson染色:肺組織切片脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染液染色，酸性乙醇分化液分化、水洗，氨水溶液返藍、水洗。然后再用蒸餾水洗，麗春紅酸性品紅染色液染色，0.5%冰醋酸水溶液沖洗，磷鉬酸溶液沖洗，0.5%冰醋酸水溶液洗。 將標本直接放入苯胺藍染色液中染色，0.5%冰醋酸水溶液洗，脫水、透明、封固。光鏡下觀察、采圖、分析計算。

2.5 免疫組化法檢測肺組織 α-SMA的表達：烤片 2 h；TO型透明劑脫臘 2次，無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、蒸餾水依次浸泡；滴入3%過氧化氫溶液，室溫孵育10 min，蒸餾水洗；切片置于EDTA抗原修復液中，用微波爐進行加熱，直至沸騰后斷電，間隔5 min后重復1次；PBS沖洗;滴加5% BSA封閉液；滴加一抗，4℃冰箱過夜，PBS液沖洗；滴加二抗，孵育20 min，PBS液沖洗；滴加試劑SABC，37℃恒溫箱中孵育20 min，PBS液沖洗； 滴加DAB顯色液，顯色后用蒸餾水沖洗；蘇木素復染，自水來沖洗至水清；1%鹽酸乙醇分化2～3 s，自來水沖洗；常規梯度乙醇脫水，透明，風干后封片；陰性對照的一抗用PBS液替代；顯微鏡下閱片、采圖、分析計算。

結 果

1 HE染色觀察各組肺組織結構 生理鹽水組：可見完整的氣道壁結構，光滑、完整的細支氣管管壁，氣管平滑肌無明顯增厚，無明顯炎癥細胞浸潤(見圖1)。RSV 感染組：氣管平滑肌明顯增厚，黏膜皺褶增多，細支氣管可見較多以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，部分肺泡腔變狹窄或消失，肺泡壁及肺泡間隔可見充血、水腫、不均勻增厚。感染第4天可見炎性細胞浸潤，第 8 天時最為明顯,之后炎癥浸潤逐漸減輕，至第 28天仍可見炎癥表現(見圖 2)。

A：生理鹽水組 4 d B：生理鹽水組 8 d C：生理鹽水組 14 d D：生理鹽水組 28 d

A：觀察組 4 d B：觀察組 8 d C：觀察組 14 d D：觀察組 28 d

2 Masson染色法觀測各組氣道外周膠原沉積面積結果 生理鹽水組(見圖 3)：氣道壁周圍在各時間點可見散在少許藍色膠原沉積，各時間點氣道外周膠原沉積面積百分比比較無明顯差異(P>0.05)；RSV感染組(見圖 4)：氣道外周膠原沉積面積百分比在感染的第4天、第8天及第14天逐漸增加，與對照組相應時間點兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)，感染第28天氣道外周膠原沉積面積百分比明顯減少，與對照組相應時間點比較，差異無統計學意義(P>0.05)。感染組各時間點比較，各時間點差異有統計學意義(P<0.05)，見表 1。

A：生理鹽水組 4 d B：生理鹽水組 8 d C：生理鹽水組 14 d D：生理鹽水組 28 d

A：觀察組4 d B：觀察組8 d C：觀察組14 d D：觀察組28 d

組 別n4d8d14d28dF值P值對照組62.01±0.192.12±0.232.05±0.242.18±0.290.160.85感染組64.56±0.75*△7.21±1.01*△10.56±0.47*△2.3±0.38*△121.080.01t值-7.5710.6125.560.28--P值-0.010.000.000.67--

注：與對照組比較*P<0.05，感染組各時間點比較△P<0.05。

3 RSV感染組及對照組各時間點肺組織α-SMA表達結果 對照組(見圖 5)小鼠肺組織α-SMA表達為弱陽性，各時間點兩兩比較，表達無顯著差異(P>0.05)；RSV感染組(見圖 6)小鼠肺組織α-SMA平均光密度值在第4天、第8天和第14天呈逐漸上升趨勢，第14天時達高峰，至第28天下降，各時間點兩兩比較，差異有統計學意義(P<0.05)。RSV 感染組小鼠肺組織α-SMA表達與對照組比較，RSV感染組第 4 天、第 8 天、第 14 天可見α-SMA陽性表達，與對照組各相應時間點比較差異有統計學意義(P<0.05)，感染第28天呈弱陽性表達，與對照組相應時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

A：生理鹽水組4 d B：生理鹽水組8 d C：生理鹽水組14 d D：生理鹽水組28 d

A：觀察組4 d B：觀察組8 d C：觀察組14 d D：觀察組28 d

組 別n4d8d14d28dF值P值對照組60.251±0.0170.261±0.0150.245±0.0230.230±0.0184.140.62感染組60.392±0.030*△0.821±0.026*△0.915±0.021*△0.249±0.013△6910.00t值-36.0340.1857.430.97--P值-0.000.000.000.39--

注：與對照組比較，*P<0.05；感染組各時間點比較，△P<0.05

討 論

RSV是引起嬰幼兒喘息最常見和最重要的病原體之一，屬副黏病毒科肺炎屬，也是兒科常見的呼吸道病原之一，且易感染呼吸道上皮細胞，RSV感染機體后能導致喘息反復，甚至哮喘，該危險因素在哮喘發病過程中既重要而又獨立。

研究表明，RSV感染小鼠肺組織病理變化最初表現為炎癥改變[7]。實驗的第3天肺組織出現大量炎性細胞浸潤,到感染的第7天，主要表現為典型的間質性肺炎改變,可見肺泡間隔內的炎性細胞明顯減少，同時可見肺泡腔擴大，部分肺泡壁斷裂融合。而這種肺部炎癥變化與我們人類大體一致,并且小鼠感染RSV后肺部的病理改變持續的時間會較長，可持續至28 d。肺部的這種持續性病理改變可能與RSV感染與日后發生哮喘的關系密切。

1 Masson染色膠原沉積變化 肺細胞外基質 (Extracellular matrix，ECM) 蛋白的一個主要成分是膠原，主要由成纖維細胞合成并分布于上皮、內皮基底膜及肺間質。膠原積聚是促使肺纖維化的一個重要特征，而氣道重塑的主要病理改變就是ECM的過度沉積[8]。本實驗通過制作RSV感染動物模型，經肺組織Masson染色后結果顯示生理鹽水組氣道外周未見或僅見少量藍色膠原沉積，而感染組小鼠氣道外周藍色膠原沉積在第4天出現，第8天增多，至14天達高峰，第28天未見或僅見少量藍色膠原沉積，相較于對照組明顯增多，從而提示RSV感染過程中出現了膠原沉積。這一結果也與導師組前期研究結果[9]相近。

2 α-SMA與氣道炎癥 現人們已認識到氣道平滑肌(Airway smooth muscle，ASM)不僅影響氣道張力，還可通過合成、分泌活性介質發揮免疫炎癥作用，這些活性介質包括黏附分子、細胞因子、蛋白酶和細胞外基質成分等，同時還可參與肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和T細胞的活化過程，是哮喘發病過程中出現支氣管痙攣和氣道急性狹窄的最終效應器官，在哮喘出現慢性氣道炎癥的發生發展過程中起重要作用。α-SMA是氣道平滑肌細胞(Airway smooth muscle cell，ASMC)的一個具有特征性的標志物，α-SMA的含量一方面可反映氣道平滑肌細胞的數量，另一方面可反映收縮能力的改變[10]。本次實驗免疫組化法檢測α-SMA結果顯示：α-SMA表達量在感染第 4 天開始出現，第8天表達量明顯增加，與本實驗研究RSV感染小鼠肺組織病理學在氣道炎癥的改變規律一致，從而推測α-SMA可能參與了RSV感染后氣道炎癥的發生、發展。雖然第14天時表達量無明顯減少，仍呈高表達，推測可能有其它因素如膠原纖維的大量沉積等同時參與RSV感染過程。

3 α-SMA與氣道重塑 近年研究發現，α-SMA具有促進細胞外基質中I型膠原過度沉積、促進支氣管管壁增厚和僵硬等功能[11]，除了在氣道平滑肌細胞中表達之外，α-SMA還可作為一種表型標志，在成纖維細胞以及上皮細胞向肌成纖維細胞轉化和活化的過程中起作用，而纖維化中最主要的效應細胞正是活化的肌成纖維細胞[12-13]。

本實驗表明：通過構造RSV感染小鼠模型后，小鼠肺組織Masson染色結果顯示，對照組各時間點氣道壁周圍未見明顯藍色膠原沉積，而RSV感染組在第 4 天可見少量藍色膠原沉積，至第8天時藍色膠原沉積明顯增多，并在第 14天時達到高峰，感染的第 28 天未見或僅見少量藍色膠原沉積，另外本實驗中RSV感染小鼠肺組織免疫組化α-SMA陽性表達從第4天開始增加，第8天明顯增多，至第14天時達到高峰，其變化與本實驗RSV感染小鼠肺組織Masson染色中膠原沉積的變化規律一致，說明RSV感染后氣道平滑肌細胞(ASMC)合成α-SMA功能增強，從而推測，α-SMA可能參與到了RSV感染膠原沉積的產生過程。本次實驗小鼠肺組織免疫組化染色見α-SMA特異表達于氣道平滑肌內，這與文獻報告一致。而其他因素如細胞外基質、血管的重構等是否同時參與氣道重塑還有待進一步研究。

綜上所述，α-SMA參與了氣道膠原沉積，因而尋找能下調膠原沉積的藥物，實現早期及時干預，從而為藥物治療提供理論依據。當然，引起RSV感染后膠原沉積的細胞因子很多，α-SMA只是其中一個指標，因而繼續尋找其他細胞因子，對探明RSV感染的發病過程有一定的臨床意義。