尖頂羊肚菌原基形成過程顯微觀察與分析

石建森，郭明慧，郭 尚，周 偉，王志偉，武 旭，李云霞

（1.山西省農業科學院食用菌研究所，山西太原030031；2.山西省農業科學院試驗研究中心，山西太原030031）

羊肚菌（Morchella spp.）是一種非常珍貴的食用菌，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）[1]。很久以來，人們一直致力于羊肚菌人工栽培的研究，并且不斷地取得一些技術上的進步，使羊肚菌的大田栽培得以實現。2015 年以來，我國的羊肚菌栽培規模迅速擴張，目前已達0.67 萬hm2左右。但遺憾的是，由于羊肚菌理論研究方面的欠缺，造成無法制定出精準的栽培工藝流程，產量一直徘徊在750～2 250 kg/hm2的水平，80%～90%的種植戶處于虧本狀態。

在羊肚菌的理論方面，原基的形成過程是一個有爭議的關鍵問題。大部分人認為，羊肚菌原基形成與平菇、香菇等擔子菌的原基形成大體類似，是由菌絲扭結形成原基的。這個理論的代表人物有OWER 等[2-6]，他們提出了以菌核為中心的羊肚菌生活史，即由菌絲形成菌核，適宜條件下菌核又萌發形成菌絲，再由菌絲扭結成原基。但是有許多試驗證明，菌核的有無與出菇與否以及產量高低之間沒有必然的聯系，有菌核產生的菌株不一定出菇，很少形成菌核的菌株同樣也可以出菇[7-9]。到目前為止，尚無菌核萌發成原基的直接證據。在后來的科學研究中，趙永昌等[9]研究發現，原基的形成數量與分生孢子形成相關，沒有分生孢子的都未形成原基。石建森等[10]的研究結果支持以上觀點，他們指出分生孢子與原基形成存在著正相關的關系，即分生孢子多的地方原基發生就多，分生孢子少的地方原基就少。

關于分生孢子在羊肚菌發育過程中的作用，國外研究者OWER 等[2，5，11]做了大量的工作，結果表明，羊肚菌的分生孢子單獨培養不能萌發[2-9]。JACOBS 等[12]及我國學者劉偉等[13]研究指出，羊肚菌的無性孢子像多數真菌的小分生孢子均難以萌發，功能上可充當有性繁殖中的不動精子的作用，而非傳統意義上的無性孢子繁殖體作用。這就暗示了分生孢子在羊肚菌的發育過程中可能要參與一個有性繁殖的過程。2017 年譚昊等[14]研究認為，羊肚菌分生孢子類似于花粉的作用，對出菇有重要意義。2019 年山西省農科院食用菌研究所石建森等[10]在大量試驗觀察的基礎上提出了一個新的理論，這個理論的主要觀點是羊肚菌原基是由分生孢子與活躍菌絲交配形成的。這個理論比較圓滿地解釋了分生孢子單獨不能萌發及分生孢子與原基形成的正相關關系。重要的是，這個理論把原基形成過程描述為分生孢子與活躍菌絲的有性交配過程，而非原來的無性菌絲扭結過程。

本研究對尖頂羊肚菌（Morchella conica）的原基形成過程進行了詳細的顯微觀察，進一步探討分析了分生孢子、活躍菌絲與原基形成的關系，是筆者所提出的羊肚菌生活史新模型的補充研究[10]，其目的是使人們從另一個角度來觀察羊肚菌原基的形成過程，從而得出更加科學的結論。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試栽培菌株為尖頂羊肚菌8 號，來自山西省農業科學院食用菌研究所菌種保藏室。

1.2 試驗方法

羊肚菌栽培試驗在山西省農業科學院東陽試驗示范基地12 號、16 號大棚進行。2018 年11 月19—20 日播種，播種后澆大水，3 d 后菌絲萌發。12 月1 日畦面上有大量氣生菌絲產生，12 月7 日棚內有結冰，畦上形成大量菌霜。2019 年2 月25 日澆出菇水，3 月21 日開始大批量出菇，發現有小菇已達1 cm。

1.3 顯微觀察

從3 月21 日起，每隔3 d 取樣一次進行顯微觀察，于山西省農業科學院食用菌研究所實驗室進行光學顯微鏡觀察與拍照。

2 結果與分析

2.1 活躍菌絲上芽基形成顯微觀察

試驗結果表明，羊肚菌播種后在土壤中分化成2 種菌絲，菌絲大體上分化成2 種形態，一是土壤表面的氣生菌絲，這種菌絲在土壤表面迅速生成分生孢子，俗稱菌霜，然后氣生菌絲快速衰退；二是土壤中形成活躍菌絲，這種菌絲常呈網絡狀、顏色深、韌性強，生命周期比氣生菌絲長。活躍菌絲在前期外表光滑、透亮（圖1-A、B），后期在澆出菇水后，土壤表面潮濕，活躍菌絲上形成許多凸起，這些凸起有的不規則，有的呈球狀（圖1-C、D、E、F）。推測這些凸起物是分生孢子與活躍菌絲接觸相互作用后有絲分裂形成的，是原基形成的最初期，暫命名為芽基。

2.2 菊花期顯微觀察

從芽基四周輻射長出新的菌絲，與活躍菌絲比較，這些菌絲呈現出顏色淺、較細、有相當的一致性，可以看出，是從芽基上延伸出來的。這些新生的菌絲宛如花瓣一樣，從側面觀察就像一朵菊花，常常連成一片，將其命名為菊花期（圖2），這是原基形成的第2 個時期。還可以觀察到在一根活躍菌絲上可以串聯形成多個原基（圖2），在某一點上也可形成2 個或2 個以上的原基。

2.3 原基分化顯微觀察

在菊花期后，緊挨土壤的新菌絲逐漸向下長入土壤中，從土壤中吸取營養，以后形成羊肚菌的假根。相對向上的一面顏色逐漸變深，由淡墨色變成深黑色，伸長形成羊肚菌的子囊果部分（圖3）。

還可以觀察到，羊肚菌原基起初在活躍菌絲的表面某一點或多點生成，隨著原基長大，活躍菌絲被原基包裹于根部，后來形成由一根菌絲串連多個原基的狀況（圖3），說明這些活躍菌絲不僅在原基形成時起著重要的作用，而且可能在假根形成前擔負著給原基輸送營養、水分的任務。

3 結論與討論

關于羊肚菌子實體的形成機制與過程是羊肚菌理論方面的一個重大問題，OWER 等[2，5]首先提出羊肚菌的子實體是由菌核長出來的，VOLK 等[3]在OWER 理論的基礎上提出一個完整的生活史模型，至今這個理論被人們廣為接受。但是在這個理論中把分生孢子完全排除在外，被后來學者的研究認為是不妥當的。趙永昌等[9-10]都觀察到羊肚菌原基的數量與分生孢子存在著正相關的關系。在生產實踐中人們常常見到的“邊緣效應”更直觀的看到了分生孢子的聚集區域會有大量原基產生。這一點可以作為分生孢子參與原基形成的直接證據。石建森等[10]提出了一個新的羊肚菌生活史模型，在這個模型中羊肚菌分生孢子與活躍菌絲相互作用才能產生原基的理論也許可以讓人們對羊肚菌原基形成機制有一個更加科學的認識。

本研究通過對羊肚菌活躍菌絲及原基形成過程的詳細觀察分析，更為明確的闡述了羊肚菌原基形成是一個分生孢子與活躍菌絲相互作用后的有絲分裂過程，而非無性的單一菌絲扭結過程。這個結論與CARRIS 等[11-13]關于羊肚菌的分生孢子在形態特征上類似于其他真菌的小分生孢子，多數真菌的小分生孢子均難以萌發，功能上可能充當有性繁殖中不動精子的作用，而非傳統意義上的無性孢子的繁殖作用的推論相吻合。MOLLIARD 等[5，2，11]的試驗均證實，羊肚菌的分生孢子均不能單獨萌發，也從另一個側面支持了本研究結果。

盡管在羊肚菌原基形成方面進行了大量的研究工作，但是還需要在細胞學水平對分生孢子、活躍菌絲、芽基、菊花期等階段的核型進行分析與研究，以進一步完善所提出的新理論。