導入野生羅勒基因的煙草對鎘脅迫的耐性與生理響應

魏克強，郭婷婷，宋 欣，龐勝喜

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.保定幼兒師范高等專科學校，河北涿州072750；3.山西大地環境投資控股有限公司，山西太原030032）

近年來，我國土壤重金屬鎘的污染狀況日趨嚴峻，對生態環境、農業生產和食品安全造成了嚴重威脅。鎘是植物生長的非必需元素，其移動性大、生物毒性強，且易被吸收、富集。利用某些植物能夠耐受鎘毒害和超量積累的特性清除環境鎘污染的技術即植物修復，是實現土壤污染治理與生態修復的有效策略。但目前可利用的野生物種極其有限，人工培育出的優良品種更是屈指可數[1-2]。植物提取是目前研究最多的一種植物修復技術，而篩選、培育超積累植物已成為當務之急[3]。

唇形科羅勒屬（Ocimum）草本植物的分布廣泛、遺傳多樣性豐富，常作為觀賞、醫藥、工業等多種用途的芳香植物而栽培[4]。近年來發現，其某些野生種對重金屬的耐受和富集能力較強，是一種潛在的鎘超積累植物[5-7]。但在嚴重污染的土壤，羅勒生長緩慢、植株矮小、生物量低，實際應用存在較大的局限性。相對于超積累植物，一些具有適應性廣、生長周期短、生物量高、富集能力強、抗逆性好等優點的作物表現出了較高的修復潛力，其中，煙草是比較理想的物種之一[8-9]。

栽培煙草（Nicotiana tabacum L.）極易將吸收的鎘富集在葉片（富集系數可達5～10），但它還不是超積累植物[10-11]。國內外利用轉基因技術改良煙草植株攝取、轉運、耐受和積累重金屬的特性已有大量的研究[12]。遠緣雜交可以促進遠緣物種間的基因漸滲、交流和重組，是將不同生物類型的優良性狀結合起來創造變異、形成新物種和新類型的重要手段，這為利用野生超積累植物的基因資源創制修復污染土壤的煙草新種質提供了可能[13-14]。

本研究以親本普通煙草78-04、羅勒（Ocimum basilicum L.）及其F2為材料，采用水培法初步分析了導入野生羅勒基因的煙草植株對鎘脅迫的耐受性與生理響應，旨在為進一步挖掘和利用基因資源開展植物修復的研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生羅勒（Ocimum basilicum L.），種子采自山西省晉中市某鋼鐵冶煉廠附近，自然晾干后保存；普通煙草（Nicotiana tabacum）栽培品種78-04，由山西農業大學煙草育種研究室提供；參考WEI 等[13-14]的方法，獲得（（Nicotiana sylvestris＋78-04）×Ocimum basilicum）雜交組合的F2材料。

1.2 試驗方法

選取籽粒飽滿的各試驗種子，以3%NaClO 浸泡消毒10 min，再以蒸餾水反復沖洗3～5 次后，分別播種于裝滿珍珠巖的發芽皿中出苗。待長至4 葉期，移入水培箱進行Hoagland 營養液（購自海博生物公司，青島）培養。每個水培箱在鋪設的泡沫板上打6 個孔，每個孔移栽1 棵幼苗，室溫（26±2）℃，光照16 h/d，緩苗7 d 后進行鎘脅迫試驗。

參考文獻[14-15]的方法，在預試驗中先設置5 個濃度的鎘（0，50，100，200，300 μmol/L CdCl2）持續處理10 d，以對照組（0 μmol/L）為參照，2 個親本材料間做對比，選出毒性癥狀差異明顯的1 個最大濃度（300 μmol/L）作為本試驗的染毒濃度。然后選擇生長健壯、長勢一致的親本幼苗，分別移栽到含300 μmol/LCdCl2的Hoagland 營養液中繼續培養，同時設不添加鎘的對照組，每個處理重復3 次。鎘以CdCl2·2.5H2O（分析純）加入營養液中，每2 d 更換一次新鮮培養液，以HCl 或NaOH 調pH 值，使pH值在6.0 左右。F2種子播種、育苗、移栽、染毒等過程以及營養液配制同上，僅設300 μmol/L CdCl2的處理組。染毒10 d 后，各處理組嚴格選取正常生長、無明顯中毒癥狀的植株待測。

1.3 測定項目及方法

按常規方法用直尺測量各植株的根長和株高。將采集的各植株用自來水洗凈，再以去離子水沖洗，用吸水紙將表面水分吸干后分為根和莖葉2 個部分，稱鮮質量；將78-04 和羅勒的各組織置于105 ℃殺青30 min，70 ℃烘至恒質量，稱干質量后粉碎過篩，HNO3-HClO4（體積比為4∶1）消化，原子吸收分光光度計測定鎘含量。

富集系數（BCF）＝植株組織中Cd 含量/培養液中Cd 含量 （1）

轉運系數（TF）＝植株地上部Cd 含量/植株根部Cd 含量 （2）

取各植株的新鮮葉片0.5 g，置于預冷的研缽中，加入50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 值7.0）5 mL在冰浴中研磨，4 ℃12 000 r/min 離心20 min，取上清待用。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定；脯氨酸（PRO）含量采用酸性茚三酮比色法測定[15-16]。

1.4 數據分析

數據分析采用Excel 2007 軟件；用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 親本幼苗耐受與富集鎘的差異分析

預試驗發現，與對照組（0 μmol/L CdCl2）相比，50～100 μmol/L CdCl2脅迫對78-04 煙草與野生羅勒幼苗的正常生長發育沒有任何影響；當鎘濃度增至200 μmol/L時，僅煙草植株呈現出新葉黃化的輕微毒性癥狀，去除重金屬后仍能正常生長。即使在300 μmol/L CdCl2的脅迫下，羅勒幼苗也能正常生長，表現出了較強的耐受能力；而部分78-04 煙草的葉片嚴重卷曲、變黃，根、莖生長緩慢，植株萎蔫、失綠，鎘去除后幾乎不能恢復生長。進一步分析表明，野生羅勒與78-04 煙草對鎘的積累量、富集系數和轉運系數也存在明顯的差異（P＜0.05）（圖1）。

2.2 對鎘脅迫耐受與生理響應的差異分析

將部分F2種子（120 粒）播種后，其發芽率可達93.3%，以300 μmol/L CdCl2對112 株幼苗染毒后，以株高、根長、生物量（鮮質量）為指標觀測幼苗的生長表型。結果顯示，在鎘脅迫下，F2分離成2 個明顯的類群：強耐受型和弱耐受型；其中，108 個植株對該濃度的毒性非常敏感，呈現出典型的中毒癥狀甚至死亡，但仍有4 個單株對高濃度的鎘極不敏感，其根、莖、葉均未見明顯的毒害癥狀，且各單株的株高、根長、鮮質量等性狀優于親本植株（P＜0.05）（表1）。

表1 鎘脅迫對親本及其F2 生長的影響

植物能夠通過多種解毒機制耐受鎘的毒性，抗氧化和滲透調節是有效的策略之一，MDA 與PRO含量以及SOD 與POD 活性是反映植物抵抗鎘脅迫能力的敏感指標。結果表明，親本煙草與羅勒對鎘脅迫的生理響應具有明顯的物種間差異（P＜0.05）；與親本比較，F2優良單株的SOD、POD 活性和PRO 含量的變化顯著（P＜0.05），其平均值分別為10.59，16.15 U/mg 和7.49 μg/g，變幅分別 達5.85～18.42，9.25～22.24 U/mg及4.35～11.83 μg/g（圖2）。

3 討論

為提高煙草耐受與富集重金屬的性狀，國內外大多采取轉基因技術[12]，但目前對羅勒的相關基因及其編碼蛋白的功能還不清楚。由于受生物種繁殖隔離機制的影響，2 個遠緣物種間的雜交往往難以獲得成功[17]。基于植物修復的目的，無論是煙草屬品種間、種間還是遠緣物種間的雜交育種研究，國內外還鮮見報道。植物的高產性狀是由多基因控制的性狀，對其改良的難度極大；而重金屬超積累性狀可能只是由少數幾個關鍵基因控制的，那么就有可能利用這些基因對高生物量的植物進行改良[18-21]，這有望選育出修復污染土壤的有價值的新材料。

利用植物凈化污染土壤的功效取決于植物吸收和向地上部轉運的能力以及對所富集重金屬的耐受與解毒能力。通常植物對鎘吸收、積累和耐受的特性是受遺傳因素嚴格控制的，且在不同物種、不同基因型和不同品種間存在明顯差異[11，22]。研究發現，在水培條件下，羅勒（Ocimum basilicum）與印度芥菜（Brassica juncea）、甘藍型油菜（Brassica napus）、天藍遏藍菜（Thlaspi caerulescens）、紫羊茅（Festuca rubra）等超富集植物的地上部鎘含量相似；在污染的土壤，其鎘的累積量高于生物量大的作物玉米（Zea mays）。丁香羅勒（Ocimum gratissimum）的鎘累積能力還與蕹菜（Ipomoea aquatica）、蕪箐（Brassica rapa）等近似，莖葉的累積量超過100 mg/kg[5-7，11-12]。本試驗采集的野生羅勒也能夠在污染土壤中旺盛生長卻未表現出毒害癥狀，可能與其長期適應生存環境所形成的特殊機制有關。

鎘脅迫會導致植物生長遲緩、葉片褪綠、生物量顯著降低甚至死亡等毒性效應，根長、生物量的變化能夠直接反映植物對鎘的耐受性[23]。鎘脅迫誘發的活性氧（ROS）產生與清除的失衡，進而導致的氧化應激、生物大分子損傷，被認為是鎘產生毒害作用的主要機制之一。植物會啟動抗氧化保護和滲透調節等防御機制來避免或減輕氧化損傷，維持植株的正常生長發育[23]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）是植物清除活性氧自由基最主要的抗氧化酶，SOD 將O2-還原成H2O2，POD 再將細胞內過量的H2O2迅速分解為H2O 和O2，以防止細胞膜脂過氧化；MDA 是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量的高低是衡量細胞自由基代謝水平和氧化損傷程度的敏感指標。脯氨酸（PRO）是水溶性最大的氨基酸，在維持細胞滲透壓、清除活性氧自由基等方面發揮著重要作用，其積累可能是植物受到逆境脅迫的一種信號[24]。

本研究顯示，親本野生羅勒符合鎘超積累植物的典型特征：地上部（莖和葉）的鎘含量達到了臨界含量標準（100 mg/kg），其富集系數（BCF）和轉運系數（TF）均大于1。與親本栽培煙草相比，F2優良單株通過增強抗氧化酶的活性、提高滲透調節物質的水平來避免或緩解毒性鎘脅迫導致的毒性作用，顯示出了較強的耐受性。目前對導致這些差異的分子機制還不清楚，可能與導入野生羅勒基因產生了新的性狀有關，這對挖掘和利用野生超積累植物蘊藏的基因資源進行植物修復研究具有重要的價值。