長尾倉鼠SSR 位點的篩選與擴增

楊新根，張育平，郭紅芳，張建珍,4，武振榮，王庭林，鄒 波，常文英，侯 玉

（1.山西大學應用生物學研究所，山西太原030006；2.山西大學生命科學學院，山西太原030006；3.山西省農業科學院植物保護研究所，山西太原030031；4.農業有害生物綜合治理山西省重點實驗室，山西太原030031；5.太原師范學院生物系，山西太原030031；6.五臺縣林業工作站，山西五臺035500）

1991 年，MOORE 等[1]提出了微衛星DNA（Microsatellite DNA）的概念，即SSR（Simple Sequence Repeats）位點，是一類由1～6 個核苷酸為重復單位組成的長達200～800 bp 的核苷酸串聯重復序列。微衛星位點中大量重復的部分很可能存在變異，變異會表現為數目的整倍性不同或序列的不完全相同，因而造成位點的多態性。而揭示這些變異，進而發現不同的SSR 在不同的種甚至不同個體間的多態性，是SSR 標記技術的目的。特定的微衛星側翼序列通常保守性較強，故將側翼DNA 片段克隆、測序，再以人工合成引物進行PCR 擴增，從而將單個微衛星位點擴增出來。由于SSR 存在數量上的變異，因此擴增產物具有多態性，不同的等位基因由不同長度代表[2]。

由于單個SSR 位點的兩側序列通常都是保守的單拷貝序列，因此近年來大量科研工作者利用SSR 標記技術研究物種多樣性及其分子進化水平等。郭頌等[3-4]曾應用13 個SSR 位點對黃胸鼠在國內的遺傳多樣性、遷移特性及其進化水平進行了研究，結果表明，鐵路、公路等重要交通線路及發達的物流網可能是加劇黃胸鼠向我國北方擴散的主要原因；黃愛軍等[5]曾通過篩選SSR 位點，分析我國境內亞洲韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）的群體結構，結果表明，其可能存在2 種不同的群體結構；NORRIS 等[6]利用15 個微衛星標記分析了來自愛爾蘭和挪威的大西洋鮭3 個養殖種群和4 個野生種群的遺傳多樣性，結果表明，野生種群多態性高于養殖種群。

長尾倉鼠（Cricetulus longicaudatus）屬于嚙齒目（Rodentia）倉鼠科（Cricetidae）倉鼠屬（Cricetulus），在我國主要分布在河北、山西、內蒙古、陜西、甘肅、青海、新疆、西藏、四川等地。長尾倉鼠一般棲息于海拔較高的次生闊葉林地帶以及較干燥的荒地、灌草叢和農田等。據山西省農業科學院植物保護研究所調查數據，在山西省，長尾倉鼠是大部分農田（晉城、臨汾、長治、呂梁、晉中、太原、忻州等地）的優勢鼠種[7-9]，有些區域（晉中、太原、忻州等地）其所占比例達70%以上，是制約山西省農業健康發展的重大害鼠。

本研究利用從山西省11 個地市共計13 個縣（市）野外捕捉的長尾倉鼠為試驗材料，通過提取其基因組DNA，利用近源種黑線倉鼠（Crietulus barabensis）的6 對SSR 位點引物（已登記在GeneBank）對長尾倉鼠基因組DNA 進行PCR 擴增[10]，并對擴增產物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）[11]，旨在通過篩選長尾倉鼠SSR 位點，摸索其擴增條件，為今后長尾倉鼠的遺傳多樣性分析提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物材料 在野外捕獲活體長尾倉鼠后，取其尾尖為DNA 提取材料。捕獲地及數量見表1。

表1 試驗鼠捕獲地及數量統計

1.1.2 試劑 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司），2×Taq PCR MasterMix 酶（天根生化科技有限公司），ddH2O，瓊脂糖，1×TAE，30%聚丙烯酰胺（生工生物工程股份有限公司），5×TBE，過硫酸銨，TEMED，GeStain 染液（全式金有限公司），NaCl。

1.1.3 儀器 電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；微型高速離心機Centrifuge 5424（北京伯樂生命科學發展有限公司）；瓊脂糖凝膠電泳槽（北京六一儀器廠）；聚丙烯酰胺凝膠電泳槽（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統（Alphalmager HP）；G1000 基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；DNA定量儀NANODROP 2000（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 試驗所采用的引物借鑒了與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠SSR 位點引物[10-12]，并由生工生物工程股份有限公司合成。具體序列以及特點列于表2。

表2 微衛星序列引物及特點

1.2.2 長尾倉鼠基因組DNA 的提取 采集長尾倉 鼠尾尖作為DNA 提取材料，用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有目標條帶后，對其進行定量分析。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反應體系如表3 所示。

表3 PCR 反應體系

PCR 反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火（引物不同溫度則不同）；72 ℃延伸30 s，34 個循環；72 ℃5 min。采用2%瓊脂糖凝膠檢測是否具有目標條帶。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 制備8%聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR 擴增產物，使用170 V 恒壓，根據條帶大小設置不同時間。加入配置好的GelStain染液，室溫放置搖床1 h。觀察結果并拍照。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取與檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 含量和質量，DNA 提取結果經瓊脂糖凝膠電泳鑒定觀察結果如圖1 所示，質量較好。經DNA 定量分析，其濃度平均達到1.8 ng/μL，表明濃度足夠，符合進行SSR 位點擴增的試驗要求。

2.2 SSR 位點篩選

應用與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠SSR 引物擴增后的電泳結果顯示（圖2），引物SSRf6 的擴增結果（F）不明顯，長尾倉鼠很可能不存在這一位點，其他5 個位點表現的多態性都較好。

3 討論

非變性聚丙烯酰胺凝膠具有很高的分辨力，能很好地分離小片段DNA（5～500 bp），甚至可以分離相差1 bp 或分離單堿基突變所引起的不同片段。但不同濃度會影響擴增條帶的清晰度。本研究為了確定分離片段所需最適聚丙烯酰胺的濃度進行了預試驗，分別測試了8%，10%，12%的聚丙烯酰胺凝膠[11]，從預試驗結果來看，8%的聚丙烯酰胺凝膠帶型最整齊且雜帶少，便于觀察分析試驗結果。

SSR 位點在基因組中存在的數量多，分布廣泛，與生物上其余的分子標記方式對比，SSR 標記的優點主要表現在：數量十分豐富，整個基因組可以被覆蓋，具有高度的多態性；由于多等位基因的特性而含有的信息量高；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；單個位點由人工引物順序決定，便于學術上的交流合作，有利于引物的開發[2]。因此，不少科研工作者把SSR 應用于遺傳多態性、遺傳進化、品種鑒定、遷移和基因流等研究中，并取得了一系列的研究成果，但將SSR 應用于長尾倉鼠的研究很少[4-6，12-14]。本研究對長尾倉鼠SSR 位點的篩選和擴增進行了探索，為今后長尾倉鼠的遺傳多樣性分析提供了一定的理論基礎。

各物種SSR 位點的獲得和篩選需要很長的過程，且費用昂貴。據有關報道，SSR 位點可通過以下途徑獲得：從研究對象的基因組中直接分離獲得；從已有的數據庫（如GenBank）中查找該物種或近緣物種的微衛星位點，或者通過近緣物種的基因組設計微衛星引物來擴增研究對象的基因組[3]。本研究應用與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠SSR 位點引物擴增，其中，5 個位點表現的多態性都比較好，表明對于近源物種來說，大部分序列是保守的，可以借鑒近源種已探究出的引物來擴增，可節約大量時間以及經費[15]。本研究結果對應用SSR 位點進行研究提供了一定的理論基礎，但對于山西省長尾倉鼠的遺傳多樣性仍需進一步分析。